异甘草酸镁抗皮炎湿疹药效学及其抗炎机制研究

论文摘要

皮炎湿疹是临床常见的皮肤病,发病率高,因其常伴有骚痒等症状严重影响生活质量。目前针对皮炎湿疹的药物治疗主要集中在激素和抗组胺类药物的对症治疗,皮炎湿疹的发病机制复杂,加上这类药物反复使用的副作用较明显,使疗效肯定且副作用较小的抗皮炎湿疹药物的研发成为临床的迫切需求。异甘草酸镁注射液是第四代甘草酸制剂,系从天然甘草中提取的甘草酸经碱催化异构化后成盐精制而得,是一种含有单一光学异构体成分的甘草酸制剂,和前几代甘草酸制剂相比具有更好的抗纤维化、抗氧化和抗细胞凋亡等功效,目前临床主要用于治疗肝脏疾病。含甘草酸苷的美能注射液,临床广泛用于炎症性疾病的治疗,并已获得批准用于抗皮炎湿疹的治疗,异甘草酸镁注射液作为新一代甘草酸制剂在抗皮炎湿疹中的作用还没有相关报道。因此异甘草酸镁注射液抗皮炎湿疹的药效学研究,能够为其应用于临床治疗皮炎湿疹类疾病提供临床前实验依据,为临床抗皮炎湿疹治疗提供新的选择。在药效学研究的基础上,进一步的机制研究是对药物和疾病的进一步了解,也是对机体功能和药物作用途径的了解,有助于新的药物的发现和突破。本课题主要研究了以下内容：第一部分：异甘草酸镁注射液抗过敏性接触性皮炎（allerge condact dermatitis,ACD）药效学研究本研究通过2,4-二硝基氟苯（2,4-Dinitrofluorobenzene,DNFB）腹部致敏和耳部激发ICR鼠建立ACD模型。取48只ICR小鼠随机分为6组：空白组,模型组,高中低三个剂量组（异甘草酸镁注射液20mg/kg, 10mg/kg,5mg/kg）及阳性药对照组（美能注射液8ml·kg-1）,每组8只,以1%DNFB腹部脱毛部位致敏,3天后1%DNFB耳部激发,药物治疗从致敏后开始以尾静脉注射给药。测定指标包括：给药前后各鼠耳厚及耳红肿情况,并进行评分；以HE染色考察各组小鼠耳病理变化情况。同时通过ELISA实验考察血清中INF-γ,IgE,IL-1β,IL-4,及IL-8等炎性细胞因子变化情况。实验结果表明,异甘草酸镁注射液能够减轻模型耳部水肿红斑程度和耳部肿胀度,缓解耳部组织炎症性病理改变,降低部分血清炎性因子水平。总体上显示了异甘草酸镁抗过敏性接触性皮炎具有明显的治疗作用,但这种治疗作用和美能注射液没有明显统计学差异。第二部分：异甘草酸镁注射液抗慢性皮炎的药效学研究本研究通过2,4-二硝基氯苯（DNCB）腹部致敏和耳部共四次激发BALB/c鼠建立慢性皮炎模型。取48只ICR小鼠随机分为6组：空白组,模型组,高中低三个剂量组（异甘草酸镁注射液20mg/kg, 10mg/kg,5mg/kg）及阳性药对照组（美能注射液8ml-kg-1）,每组8只,以7%DNCB腹部脱毛部位致敏,3天后0.3%DNCB耳部激发,隔两天激发一次,共激发四次,药物治疗从致敏后开始以尾静脉注射给药。测定指标包括：给药前后各鼠耳厚及耳红肿情况,并进行评分；以HE染色考察各组小鼠耳病理变化情况。同时通过ELISA实验考察血清中INF-γ,IgE,IL-1p,IL-4,及IL-6等炎性细胞因子变化情况。实验结果表明,异甘草酸镁注射液能够减轻慢性皮炎模型耳部水肿红斑程度和耳部肿胀度,缓解耳部组织炎症性病理改变,降低模型部分血清炎性因子水平。总体上显示了异甘草酸镁对慢性皮炎模型具有一定的治疗作用,同时这种治疗作用和美能注射液的治疗作用没有明显统计学差异。第三部分：异甘草酸镁抗炎机制初步探索在药效学研究基础上,通过对建立的动物模型采集的耳标本作免疫组化检测发现,异甘草酸镁治疗后耳局部组织TNF-α、IFN-γ和NF-κB表达有明显的下降；培养人真皮成纤维细胞,以TNF-a刺激细胞激活NF-κ信号通路建立细胞模型,不同浓度异甘草酸镁药物干预,以免疫印迹技术检测核因子NF-κB表达和激活,发现异甘草酸镁能够抑制NF-κB的激活过程,减少NF-κB转位入核,减少细胞整体NF-κB的表达；通过报告基因技术,发现一定浓度异甘草酸镁能够抑制NF-κB的表达；同时在细胞模型基础上,通过RealtimePCR检测IκBα的mRNA水平,结果表明异甘草酸镁没有明显影响IκBα基因的上调。通过药效学研究显示异甘草酸镁注射液在抗皮炎湿疹中具有一定的疗效,且这种疗效和美能注射液没有明显的差异；通过分子生物学实验研究发现,异甘草酸镁抗皮炎的机制可能和抑制TNF-α-NF-κB通路的激活有关,异甘草酸镁影响通路的环节可能不在IκBα蛋白量的变化上,而是通过抑制NF-κB本身的生成和激活起作用。

论文目录

• 摘要
• 英文摘要
• 缩略词表
• 前言
• 第一部分 异甘草酸镁注射液抗过敏性接触性皮炎药效学实验
• 一、实验材料
• （一） 动物
• （二） 主要试剂及仪器
• 二、实验方法
• （一） 小鼠过敏性接触性皮炎（Allergy Contact Dermatitis,ACD）模型的建立
• （二） 给药途径
• （三） 分组及给药
• （四） 指标检测
• 三、实验结果
• （一） ACD模型成功建立
• （二） 异甘草酸镁注射液对小鼠过敏性接触性皮炎水肿红斑评分和耳厚的影响
• （三） 异甘草酸镁注射液对小鼠过敏性接触性皮炎模型耳皮肤炎症的影响
• （四） 异甘草酸镁注射液对小鼠过敏性接触性皮炎模型血清炎症因子的影响
• 四、讨论
• 第二部分 异甘草酸镁注射液抗慢性皮炎药效学实验
• 一、实验材料
• （一） 动物
• （二） 主要试剂及仪器
• 二、实验方法
• （二） 小鼠慢性皮炎模型的建立
• （二） 给药途径
• （三） 分组及给药
• （四） 指标检测
• 三、实验结果
• （一） 慢性皮炎模型的成功建立
• （二） 异甘草酸镁注射液对小鼠慢性皮炎湿疹模型耳厚和水肿红斑评分的影响
• （三） 病理学检测结果
• （四） ELISA法测定结果
• 四、总结和讨论
• 第三部分 基于NF-κB通路的异甘草酸镁抗炎机制探索
• 第一节 ACD模型经异甘草酸镁药物干预后耳标本中炎性因子水平变化情况
• 一、实验材料
• （一） 实验动物
• （二） 实验试剂
• （三） 主要仪器设备
• 二、实验方法
• （一） 动物处理
• （二） 小鼠组织表达TNF-α,INF-γ和NF-κB的免疫组化研究
• 三、实验结果
• （一） 异甘草酸镁对耳组织局部INF-γ表达的影响
• （二） 异甘草酸镁对耳组织局部TNF-α表达的影响
• （三） 异甘草酸镁对耳组织局部NF-κB p65表达的影响
• 四、讨论
• 第二节 异甘草酸镁对TNF-α刺激后成纤维细胞中NF-κB激活和表达的影响
• 一、实验材料
• （一） 细胞及试剂
• （二） 设备和仪器
• 二、实验方法
• （一） 细胞培养
• （二） 药物对成纤维细胞生存性的影响
• （三） Western-blotting检测成纤维细胞中NF-κB表达变化
• （四） real-time PCR检测成纤维细胞IκBα的mRNA变化
• （五） 报告基因检测异甘草酸镁对TNF-α刺激成纤维细胞后NF-κB表达的影响
• 三、实验结果
• （一） 人真皮成纤维细胞培养
• （二） 异甘草酸镁对细胞生存性的影响
• （三） Western-Blotting法检测异甘草酸镁对不同时间TNF-α处理后NF-κB的表达变化
• （四） 异甘草酸镁对TNF-α刺激成纤维细胞后NF-κB表达的报告基因研究
• （五） Real-time PCR检测异甘草酸镁对IκBα的mRNA表达的影响
• 四、总结和讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 文献综述
• 附录
• 致谢