论文摘要
哺乳动物神经系统的发育是一个复杂的过程,包含有多层次基因的表达与调节。真核细胞的形状维持、迁移以及结构重建都离不开胞内的纤维状网络结构----细胞骨架。不仅如此,在神经元中细胞内纤维网络的维持对将兴奋由胞体向突出连接末端传递的准确性与高效性十分必要,MAP家族（Microtubule-Associated Proteins, MAPs）在这一过程中发挥重要的作用。微管相关蛋白2（microtubule-associated protein2, MAP2）是MAP家族的主要成员之一,除了在微管装配、突触生长以及微管与神经细胞其他组分的信息通讯方面发挥重要作用外,MAP2的表达异常还与神经退行性疾病的发生密切相关。已有研究表明,针对异常的神经元细胞骨架相关蛋白合理用药,即可有效遏制神经退行性疾病的发生或缓解其症状。本文主要研究了全反式维甲酸RA（all trans retinoid acid, atRA）对小鼠畸胎瘤细胞系p19细胞的分化的作用,随着RA处理时间延长,细胞由均匀贴壁到逐渐聚集成团,突出（树突和轴突）越来越长,实时荧光定量PCR（q-PCR）及Western印迹结果提示RA可促进神经分化标志基因map2的表达；继而对map2基因启动子区的染色质重塑机制以及转录相关因子的结合进行了研究,初步探讨了RA诱导过程中map2表达与调控的机制。一、RA与p53对map2基因表达的调控作用RA对map2基因启动子活性的影响：构建带有小鼠1.3kb的map2基因上游调控区序列的pGL3-map2-1.3k质粒。将报告基因表达质粒pGL3-map2-1.3k和内参照质粒pRL-TK瞬时共转染P19细胞之后加入RA进行诱导处理,启动子活性分析结果表明：RA可以激活map2基因启动子活性。p53对map2基因启动子活性的影响：p53表达质粒与pGL3-map2-1.3k以及pRL-TK瞬时共转染P19细胞,启动子活性分析结果表明,p53可以促进map2基因的启动子活性,突变的p53表达质粒可以减弱这种激活作用：RA处理可以加强p53对map2基因的激活,同时免疫荧光结果显示RA处理可以促进p53入核,提示RA可能通过p53间接调节map2基因的表达。二、组蛋白乙酰基转移酶修饰因子对map2基因启动子活性的影响组蛋白乙酰基转移酶（HAT）组分PCAF表达质粒或p300表达质粒分别与上述pGL3-map2-1.3k-luc以及内参质粒瞬时共转染P19细胞,双荧光分析结果表明,PCAF可以增强map2基因启动子的活性,这一趋势会随着RA处理时间的延长愈加明显；无论p300蛋白还是HAT突变的p300蛋白都只能少量增加map2基因启动子的活性,并且RA的加入对启动子活性的变化几乎没有影响。三、RA组蛋白乙酰基转移酶修饰因子及转录因子p53与map2基因上游调控区结合的影响应用染色质免疫沉淀技术研究了组蛋白乙酰基转移酶修饰因子及p53对map2基因表达的影响。对p300,PCAF, p53, Ac-p53, H3K9-Ac以及PolⅡ抗体在RA处理P19细胞前后,与map2基因启动子区的结合状况进行了研究,ChIP实验结果表明：随着RA诱导时间的延长map2基因启动子H3K9的乙酰化状态发生位置变化,诱导之初（0d、1d）乙酰化发生在1.3kb片段上游-800～-1000bp,到第2d后迁移到近端约-500bp处。组蛋白的乙酰化意味着染色质处以开放状态,为map2转录将要进行提供了可能性；组蛋白乙酰基转移酶p300在RA诱导p19细胞第2d起与map2基因启动子区远端-800～-1000bp处结合,其结合强度大约是RA处理前的6倍；无论RA是否诱导,PCAF始终结合于map2基因启动子上,在RA诱导第4天时与启动子的结合最强；RA处理第2天后map2基因启动子上K373、K382乙酰化的p53结合的量有所增加,这暗示ac-p53可能通过调控map2的转录表达发挥其促进分化的作用。RA处理p19细胞到第四天时Pol II与p53结合于基因启动子转录起始位点附近（-284～+40bp）,后者暗示map2的转录即将进行；总结上述,随着RA诱导时间延长,乙酰化p53和p53结合于map2基因启动子区,同时组蛋白H3K9乙酰化由启动子区的远端向近端移动,PCAF对map2基因启动子区的结合逐渐增强。因而我们推测：RA处理P19细胞促进p53由胞质入核,一部分入核的p53促进PCAF的表达（另有文献报道）,核内PCAF乙酰化酶复合物（可能结合p300作为coactivitor）与p300乙酰化p53,促进其结合于map2基因启动子区,同时PCAF与p300／CBP乙酰化map2基因启动子区的组蛋白N末端氨基酸残基（如H3K9）,使该基因启动子区的染色质结构变得松散,ac-p53在共激活因子辅助下将以PolⅡ为主的转录机募集到map2转录起始位点附近,促进map2基因的转录。本研究探讨了atRA处理小鼠畸胎瘤细胞系p19细胞后对神经分化标志基因map2表达的影响,进而探讨了RA诱导过程中map2表达调控的机制,为神经退行性疾病的临床治疗提供新的思路。
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标签：微管相关蛋白论文; 基因表达论文; 小鼠畸胎瘤细胞系细胞论文; 乙酰化论文;