论文摘要
日本脑炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）和登革病毒（dengue virus,DEN）为重要的经蚊媒传播的黄病毒。目前,对这两种病毒致病的分子机理尚不清楚,因而阻碍了新型疫苗和特异药物的研发。临床研究发现,日本脑炎病毒和登革病毒的复制均可抑制患者体内Ⅰ型干扰素的抗病毒作用。为此,本研究试图比较和探讨日本脑炎病毒Beijing-1株和登革2型病毒43株以及二者编码的非结构蛋白在宿主细胞内IFN-α介导的信号转导通路中的作用机制,不但为深入了解蚊媒黄病毒致病的分子机理奠定基础,而且对Ⅰ型干扰素在病毒病临床治疗中的合理应用亦具有指导意义。一、日本脑炎病毒和登革病毒在IFN-α介导的信号转导通路中的作用首先利用含萤火虫荧光素酶报告基因的载体pISRE-Luc,通过检测荧光素酶活性对病毒感染细胞内IFN-α介导的JAK-STAT信号转导通路的抑制程度进行定量分析。结果显示,感染登革病毒的细胞在IFN-α作用下,萤光素酶活性仅为对照组的73%;而感染日本脑炎病毒的细胞则更低,仅为对照组的12%。表明日本脑炎病毒和登革病毒均可抑制细胞内IFN-α介导的JAK-STAT信号转导通路,而且日本脑炎病毒对宿主细胞内信号转导通路的抑制作用明显强于登革病毒。为进一步分析日本脑炎病毒和登革病毒抑制宿主细胞内IFN-α介导的JAK-STAT信号转导通路的作用机制。本研究利用间接免疫荧光法观察了在IFN-α作用下病毒感染细胞内的STAT1分子的分布情况。并采用Western blotting分别检测了在这两种病毒感染状态下宿主细胞内STAT1分子的磷酸化水平。发现日本脑炎病毒和登革病毒均可抑制宿主细胞内IFN-α介导的STAT1分子的核转运;而且在病毒感染细胞中STAT1分子的磷酸化水平明显下降,但总的STAT1分子表达量未见改变。表明这两种病毒感染并未影响细胞内STAT1分子的表达,而是抑制了STAT1分子的磷酸化,从而阻断了STAT1的核转运,导致IFN-α介导的JAK-STAT信号转导通路的中断。由于STAT1分子的磷酸化是由其上游激酶分子JAK1和TYK2完成的。为此,本研究对两种病毒感染细胞内的JAK1和TYK2分子的磷酸化水平分别进行了检测。结果显示,在日本脑炎病毒感染的细胞内,TYK2和JAK1激酶的磷酸化水平均受到了明显抑制。而在登革病毒感染细胞中仅TYK2分子的磷酸化水平显著下降,JAK1分子的磷酸化未受影响。说明日本脑炎病毒同时干扰了JAK1和TYK2两种激酶的活化,导致STAT1分子磷酸化水平降低,从而阻断了JAK-STAT通路的信号转导;而登革病毒感染仅抑制了宿主细胞内TYK2分子的磷酸化,从而降低STAT1分子的磷酸化水平。这表明日本脑炎病毒和登革病毒可能通过不同的作用机制抑制IFN-α介导的JAK-STAT信号转导通路。二、日本脑炎病毒和登革病毒的非结构蛋白在IFN-α介导的信号转导通路中的作用为深入了解日本脑炎病毒和登革病毒抑制Ⅰ型IFN介导的JAK-STAT信号转导通路的作用机制,本研究分别构建了二者编码的7种非结构蛋白（NS1,NS2A,NS2B,NS3,NS4A,NS4B和NS5）的重组真核表达载体,观察它们在细胞内的表达情况,以及对IFN-α介导的信号转导通路的作用,以期阐明在这两种病毒抑制IFN-α介导的JAK-STAT信号转导通路过程中发挥关键作用的病毒特异蛋白。首先利用含萤火虫荧光素酶报告基因的载体pISRE-Luc,在表达病毒非结构蛋白的细胞内,定量分析了IFN-α介导的JAK-STAT信号转导通路的活化状态。同时,为便于观察病毒非结构蛋白对IFN-α介导的信号转导通路的作用,构建了融合表达红色荧光蛋白的STAT1重组真核表达载体pRed-STAT1。将表达病毒非结构蛋白的重组载体与pRed-STAT1共转染细胞,观察融合蛋白Red-STAT1在IFN-α作用下的细胞内定位情况。并观察了表达病毒非结构蛋白的细胞内IFN-α介导的STAT1分子的磷酸化水平。结果显示,日本脑炎病毒和登革病毒的非结构蛋白均可在哺乳动物细胞内正确表达,其中仅登革病毒的NS5定位于细胞核内,其它非结构蛋白均位于细胞质中。在日本脑炎病毒的7种非结构蛋白中,NS5不但显著抑制了IFN-α介导的细胞内JAK-STAT信号转导通路的活化,而且阻断了STAT1分子的核转运及其磷酸化水平。但并未发现登革病毒的NS5以及其它病毒非结构蛋白对JAK-STAT信号转导通路具有明显影响。表明日本脑炎病毒的非结构蛋白NS5对Ⅰ型IFN系统的信号转导通路具有显著的抑制作用,它可能是一种Ⅰ型IFN系统的拮抗蛋白。而登革病毒对Ⅰ型IFN系统的抑制作用并不依赖某一单独的非结构蛋白的表达,可能是通过多种病毒蛋白的协调作用或其它方式完成。三、登革病毒NS4B在Ⅰ型干扰素系统中的作用尽管有报道指出登革病毒NS4B具有抑制Ⅰ型干扰素信号转导通路的作用,但在本研究系统中并未得到证实。为进一步探讨登革病毒NS4B的相关功能,本研究根据登革2型病毒NS4B的跨膜区预测结果,分别在真核系统中表达了NS4B的8个不同区域,并发现NS4B氨基端的54个氨基酸残基对其正确表达可能具有重要作用。同时,利用重组载体pRed-STAT1初步分析了NS4B的不同区域在IFN-α介导的信号转导通路中的作用,结果表明,这些区域并未影响IFN-α介导的JAK-STAT信号转导通路。可见登革病毒NS4B对Ⅰ型干扰素系统的作用还有待进一步探讨。另外,本研究还在原核系统中表达了登革2和4型病毒的NS4B,并制备了相应的多克隆抗体。在此过程中,发现NS4B羧基端的一级结构在决定其免疫原性方面可能具有重要作用。以上这些结果为进一步探讨登革病毒NS4B对Ⅰ型干扰素系统作用的相关功能奠定了基础。本研究对日本脑炎病毒和登革病毒及其相关的主要非结构蛋白在IFN-α介导的信号转导通路中的作用机制进行了初步探讨,为进一步开展其它蚊媒黄病毒的相关研究提供了依据。