正常及早期糖尿病大鼠视网膜的蛋白组学初步研究

论文摘要

糖尿病及其并发症的防治是关乎国计民生的重大课题,糖尿病眼部并发症占到糖尿病并发症的20%～24%,其中糖尿病视网膜病变（Diabetic Retinopathy,DR）是最主要的致盲原因。长久以来DR的血管病变机制一直是临床防治及基础研究的重点。然而近十年来DR的发病机制研究已逐渐转向了对早期糖尿病视网膜神经退行性变原因的探讨。糖尿病作为一种多因素的全身性疾病,高糖代谢、超氧化物和糖基化终末产物（AGEs）等代谢毒性物质的积聚、缺血缺氧、氧化应激、炎症及免疫反应等等均可最终导致神经组织凋亡、胶质增生等病理改变。糖尿病发病伊始有哪些蛋白因子作为“扳机”触发了这些病理改变呢?随着病程的延长,又有哪些因子参与进来呢?它们之间有哪些联系呢?近年来迅速发展的蛋白质组学研究,具有观察由多基因事件引起的多蛋白质组分整体变化的独特优势,更接近生命现象的本质,能动态、整体、定量地考察疾病发生发展过程中全部蛋白质种类和数量的变化,对于探讨疾病机理、寻找疾病诊断的特异标志物和药物治疗的靶标来说,是一种有效的高通量的研究模式,可获得一些传统手段无法得到的新蛋白标志物和关键分子,极大地丰富诊断标志物的选择组合,并有助于复杂致病机理的全面阐明,目前已被广泛用于研究各种疾病的发生、发展规律,并取得了很多重大的成就。本硕士研究生论文工作是复旦大学眼耳鼻喉科医院玻璃体视网膜疾病课题组与复旦大学上海医学院生物医学平台的合作项目。本研究工作的主要贡献为:采用STZ诱导的糖尿病大鼠模型,对成模早期（成模后1,2,4,6,8周内）5组时点及正常大鼠的神经视网膜进行了蛋白组学液相色谱串联质谱分析。研究初步建立了基本的正常大鼠视网膜的蛋白谱,以此作为研究早期糖尿病大鼠视网膜蛋白表达差异的基础线,我们对各时点比较后得到差异蛋白,筛选早期糖尿病视网膜神经病变相关因子,同时按早期糖尿病病程建立时间梯度曲线,从而为进一步纵向功能性研究打下基础。为临床糖尿病视网膜病变的早期防治提供了新思路。本论文由四部分组成。第一章前言首先概述了早期糖尿病视网膜病变机制的研究进展,提出早期糖尿病视网膜即可出现神经退行性变,其病变机制是由多因素、多通路控制的,故而需要引入蛋白组学为研究开拓思路,提供新线索。然后概述了蛋白质组学这一新兴学科发展现状和技术进展,包括双相凝胶电泳技术,生物质谱技术,色谱分离技术,蛋白质芯片技术等。然后概述了蛋白组学在糖尿病视网膜病变机制研究中的应用进展,提出本课题工作的研究方向。第二章所述工作为论证蛋白组学研究视网膜样本的可行性,以及选择恰当的蛋白组学研究方案,先用正常大鼠神经视网膜样品进行蛋白组学预试验。本实验中共从6只SD大鼠、12只眼的神经视网膜中提取到了蛋白3 mg,进行2-PADE电泳跑胶,考马斯亮蓝染色后得到了清晰的条带和蛋白点。故提示大鼠视网膜的蛋白组研究对蛋白样品量要求至少达到3mg以上,才能得到较清晰的结果。也就是实验设计中要求每组样品至少有6只以上大鼠的双眼视网膜方可达到蛋白组分析的定量要求。为了提高研究的敏感性及特异性,最终决定采用蛋白组学液相色谱串联质谱分析法（SCX-RPLC-MSMS）作为研究方法。第三章所述工作用高剂量（65mg/kg）STZ成功建立了Ⅰ型糖尿病大鼠模型,共有43只大鼠成模,造模成功率为74.1%。大鼠模型表现出典型Ⅰ型糖尿病症状。5组糖尿病大鼠自成模后血糖浓度保持在16.7mmol/L以上,并且较稳定。对照组血糖浓度无明显波动,基本在5.88±0.01mmol/L左右。糖尿病大鼠体重随着日龄的增加而减轻,对照组的体重随着日龄的增加而增加。本实验所用的模型为糖尿病模型造模成功后8周、6周、4周、2周及1周内的大鼠,为目前公认的早期糖尿病大鼠模型。第四章所述工作建立了正常大鼠神经视网膜全蛋白质表达谱并且以正常组为基线,对5组时点的早期糖尿病大鼠神经视网膜进行了液相色谱串联质谱分析。共获得207个差异蛋白的定性定量信息。这些差异蛋白中有11个仅存在于正常大鼠视网膜中,其余为正常及早期糖尿病大鼠视网膜所重叠共有,并且随病程的发展其表达在各时点有所不同。其中又有177个从发病后一周及两周后就出现了显著的表达变化,并且随病程的发展呈现不同的变化曲线。这些差异蛋白涉及多种蛋白功能,如细胞结构、信号转导、代谢调控、应激反应、神经元功能、视觉功能等等。由于蛋白数量庞大,蛋白的分类及功能论证工作尚未完成,故而无法对所有差异蛋白进行全面阐述。本文仅着重探讨了以下几种具有重要意义的蛋白:高移动族核小体结合域家族的Hmgn1、酪氨酸3单加氧酶（Ywhag 14-3-3 protein）、神经元蛋白激酶酪氨酸底物（Pacsin1,Protein kinase C and caseinkinase substrate in neurons protein 1）以及水通道蛋白—4（AQP4 IsoformShort of Aquaporin-4）。它们随病程发展有不同的表达变化,并且与早期糖尿病的视网膜病变机制有着密切关系。本工作建立了正常SD大鼠神经视网膜的蛋白质组数据库,其中包含386个非冗余的蛋白质,这一数据库对大鼠视网膜相关研究具有较高的参考价值。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.研究背景
• 1.1 早期糖尿病视网膜病变机制的研究进展
• 1.2 蛋白组学概述
• 1.3.蛋白组学在糖尿病视网膜病变机制研究中的应用
• 2.本研究的目的、意义和特色
• 2.1 研究目的和意义
• 2.2 研究特色
• 第二章 大鼠视网膜组织的蛋白组学研究方法的建立
• 1.目的
• 2.材料和试剂
• 3.实验步骤
• 3.1 样品处理
• 3.2 双相凝胶电泳（2-DE）
• 4.结果及讨论
• 5.结论:
• 第三章 糖尿病大鼠模型的建立
• 1.动物和试剂
• 1.1 动物
• 2.1 主要试剂
• 2.模型的建立
• 3.结果及讨论
• 第四章 正常及早期糖尿病大鼠视网膜的蛋白组学初步研究
• 1.目的
• 2.主要材料和试剂
• 2.1 样品
• 2.2 主要试剂和仪器
• 3.实验步骤
• 3.1 蛋白提取和定量
• 3.2 蛋白纯化
• 3.3 iTRAQ标记肽段
• 3.4 4700TOFTOF质谱分析
• 3.5 SCX-RPLC-MSMS分离肽段及蛋白的鉴定
• 4.结果与讨论
• 4.1 大鼠视网膜样品蛋白组液相色谱串联质谱分析相关谱图
• 4.2 正常大鼠视网膜的蛋白谱
• 4.3 正常及早期糖尿病大鼠视网膜对比所得差异蛋白的初步统计
• 4.4 一些重要差异蛋白及其时间梯度曲线
• 5.结论
• 附录一:参考文献
• 附录二:综述
• 致谢