论文摘要
注意缺陷多动障碍（Attention Deficit Hyperactivity Disorder,ADHD）是儿童常见的神经行为问题,发病率达2.59%～7.25%,严重影响儿童的身心健康和学习生活,因此,有关ADHD的研究一直是儿科学领域的热点之一。然而,由于ADHD涉及脑的多个解剖部位及神经递质传递系统异常,以及以人体为研究对象存在局限性,其相关研究仍是,21世纪医学难点之一。Homer 1、Homer 2是本课题组先前通过基因芯片筛选出的差异表达于目前广泛应用的ADHD动物模型SHR/WKY大鼠（Spontaneously Hypertensive Rat,SHR/Wistar Kyoto,WKY）前额叶的基因。Homer 1、Homer 2同属Homer家族成员,各自存在多种不同剪切形式,其编码的蛋白是新发现的一类位于突触后膜的重要信号转导调节蛋白,主要通过和代谢型谷氨酸受体（groupⅠmetabotropicglutamate receptor,mGluRⅠ）、三磷酸肌醇受体（inositol trisphosphate,IP3R）、Shank等蛋白结合,在突触后致密斑的重塑、受体细胞定位、突触前后信号转导、突触形成中起重要作用。因此,提示该基因可能参与到ADHD的病因及发病机制中,然而国内外均未见相关报道。本课题分两部分,通过观察Homer不同亚型在SHR/WKY大鼠不同脑区的表达差异情况,以及探讨临床常用药物-盐酸哌甲酯（methylphenidate,MPH）对SHR大鼠行为、Homer及其相关基因mGluRⅠ、IP3R、Shank表达的影响,来阐明Homer与ADHD之间的密切关系。本研究是针对注意缺陷多动障碍发病机制的探索性研究,有利于了解儿童ADHD的神经生物学机制,研究结果将为ADHD发病机制及治疗机理提供新的线索和理论依据。目的分析Homer不同亚型在ADHD动物模型幼年SHR大鼠,及其对照组WKY大鼠不同脑区差异表达情况。方法（1）开场实验观察幼年SHR/WKY大鼠自发活动情况;（2）应用RT-PCR、WesternBlotting技术检测SHR/WKY大鼠前额叶、海马、伏核、纹状体等脑区中Homer 1a、Homer 1b/c、Homer 2a/b mRNA和蛋白表达情况。结果（1）开场实验显示,SHR大鼠水平活动、直立次数均较对照WKY大鼠显著增高,差异具有统计学意义（t=8.34,p＜0.05;t=4.43,p＜0.05）;（2）RT-PCR结果显示,SHR大鼠前额叶中Homer 1a、Homer 2a/bmRNA表达丰度较WKY大鼠显著降低,差异具有统计学意义（t=2.56,p＜0.05;t=5.85,p＜0.05）,而Homer 1b/c无显著性差异。SHR大鼠海马中Homer 1a、Homer 2a/b mRNA表达丰度较WKY大鼠显著降低,差异具有统计学意义（t=2.95,p＜0.05;t=2.66,p＜0.05）,而Homer 1b/c无显著性差异。SHR大鼠伏核中Homer 2a/b mRNA表达丰度较WKY大鼠显著降低,差异具有统计学意义（t=2.66,p＜0.05）,而Homer 1a、Homer 1b/c无显著性差异。SHR大鼠纹状体中Homer 1a、Homer 1b/c、Homer 2a/b mRNA表达丰度与WKY大鼠均无显著性差异;（3）WesternBlotting结果发现,SHR大鼠前额叶中Homer 1a、Homer 2a/b蛋白表达丰度较WKY大鼠显著降低,差异具有统计学意义（t=2.76,p＜0.05;t=3.40,p＜0.05）;SHR大鼠海马中Homer 1a、Homer 2a/b蛋白表达丰度较WKY大鼠显著降低,差异具有统计学意义（t=4.31,p＜0.05;t=3.27,p＜0.05）。结论（1）本实验所用幼年SHR大鼠自发活动水平显著高于对照WKY大鼠,符合作为ADHD动物模型的要求;（2）SHR大鼠前额叶、海马脑区Homer 1a、Homer 2a/b表达较WKY大鼠显著降低,伏核Homer2a/b mRNA表达亦较WKY大鼠显著降低,提示Homer 1a、Homer 2a/b可能与ADHD密切相关。目的观察盐酸哌甲酯对SHR大鼠行为、Homer及其相关基因mGluRⅠ、IP3R、Shank表达的影响。方法（1）急性给药前,利用开场实验观察盐酸哌甲酯给药组（MPH组）与生理盐水对照组（Ctl组）基础的自发活动水平（指水平运动和直立次数）有无差异;急性给药后（盐酸哌甲酯2mg/kg或生理盐水灌胃（intragastric gavage,i.g.）单次给药）,利用Làt迷宫观察两组在自发活动水平和非选择性注意力水平（指斜搭次数）有无差异。慢性给药前,利用Làt迷宫评价MPH组与Ctl组基础的自发活动水平和非选择性注意水平;慢性给药后（盐酸哌甲酯2mg/kg或生理盐水i.g.bid持续给药14天）,第15天通过Làt迷宫、第16-18天通过Morris水迷宫,分别观察两组自发活动水平、非选择性注意力水平和学习记忆（指总路程和潜伏期）有无差异。（2）完成急、慢性给药各自的行为学实验后,立即断头处死大鼠,采用RT-PCR、Western Blotting技术检测MPH组与Ctl组在急、慢性给药后,前额叶、海马中Homer 1a、Homer 2a/b mRNA和蛋白的表达有无差异,及其相关基因mGluR 1、mGluR 5、IP3R 1、IP3R 2、IP3R3、shank 1、Shank 2、Shank 3 mRNA表达有无差异。结果（1）急性给药实验,动物行为学检测结果显示:给药前,MPH组与Ctl组在开场中水平运动距离和直立次数方面均无显著差异;给药后,MPH组在Làt迷宫中的水平运动距离、直立次数、斜搭次数均较Ctl组有下降趋势,但差异无统计学意义;（2）急性给药实验,分子生物学检测结果显示:给药后,Homer 1a mRNA在MPH组前额叶、海马中的表达丰度较Ctl组显著增加,差异具有统计学意义（t=2.41,p＜0.05;t=2.68,p＜0.05）;Homer 1b/c、Homer 2a/b、mGluR 1、mGluR 5、IP3R1、IP3R 2、IP3R 3、Shank 1、Shank 2、Shank 3 mRNA表达,两组间无显著性差异;Homer 1a蛋白在MPH组前额叶、海马中的表达丰度亦较Ctl组显著增加,差异具有统计学意义（t=3.21,p＜0.05;t=4.07,p＜0.05）,Homer 2a/b蛋白表达两组间无显著性差异（p＞0.05）。（3）慢性给药实验,动物行为学检测结果显示:给药前,MPH组与Ctl组在Làt迷宫中的水平运动距离、直立次数、斜搭次数均无显著性差异;给药后,MPH组在Làt迷宫中的水平活动、直立次数、斜搭频数均较Ctl组显著减少,差异具有统计学意义（t=3.63,p＜0.05;t=3.24,p＜0.05;t=3.98,p＜0.05）;MPH组在Morris水迷宫中第一天总路程和潜伏期较Ctl组尚无显著性差异,第二、第三天MPH组总路程较Ctl组显著减少,差异具有统计学意义（t=2.36,p＜0.05;t=2.30,p＜0.05）,第二、第三天MPH组潜伏期亦较Ctl组显著减少,差异具有统计学意义（t=2.76,p＜0.05;t=2.51,p＜0.05）。（4）慢性给药实验,分子生物学检测结果显示:Homer 1a、Homer 2a/b、Shank 1 mRNA在MPH组前额叶中的表达丰度较Ctl组显著升高,差异具有统计学意义（t=2.82,p＜0.05;t=2.73,p＜0.05;t=3.34,p＜0.05）,mGluR 1、mGluR 5、IP3R 1、IP3R 2、IP3R 3、Shank 2、Shank 3 mRNA表达两组间无显著性差异;Homer 1a、Homer 2a/b、shank 1 mRNA在MPH组海马中的表达丰度较Ctl组显著升高,差异具有统计学意义（t=3.12,p＜0.05;t=2.36,p＜0.05;t=2.74,p＜0.05）,mGluR 1、mGluR 5、IP3R 1、IP3R2、IP3R 3、Shank 2、Shank 3 mRNA表达两组间无显著性差异;Homer1a、Homer 2a/b蛋白在MPH组前额叶中的表达丰度较对照组（Ctl组）显著升高,差异具有统计学意义（t=4.41,p＜0.05;t=2.62,p＜0.05）;Homer 1a、Homer 2a/b蛋白在MPH组海马中的表达丰度较对照组（Ctl组）显著升高,差异具有统计学意义（t=3.04,p＜0.05;t=2.87,p＜0.05）。结论盐酸哌甲酯单次用药在引起前额叶和海马Homer 1a mRNA和蛋白表达增加的同时,改善了SHR大鼠的多动和注意力障碍现象;盐酸哌甲酯长期用药在引起前额叶和海马Homer1a、Homer 2a/b mRNA和蛋白表达增加的同时,改善了SHR大鼠的多动、注意力障碍和学习记忆困难现象,并引起了前额叶和海马脑区Shank 1 mRNA表达增加,提示Homer 1a、Homer 2a/b不仅参与了ADHD的发病机制,并且可能在盐酸哌甲酯治疗ADHD的作用机制中起重要作用。
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