一、脑胶质细胞瘤患者IL-6的表达及细胞免疫功能的变化（论文文献综述）
赵津璋[1]（2021）在《脑胶质瘤中CXCL1的表达及影响肿瘤细胞恶性行为的作用机制研究》文中研究指明目的:CXCL1属于CXC-类趋化因子家族成员,其除了参与免疫细胞活化外,还参与多种细胞反应。近年来研究显示,CXCL1在人类多种肿瘤中表达上调,并参与了肿瘤细胞的增殖、转移和肿瘤血管形成等恶性行为。本研究旨在明确和探讨CXCL1在人类脑胶质瘤中的表达及外源性重组CXCL1对大鼠C6脑胶质瘤细胞增殖和迁移的影响及作用机制,该研究有利于帮助人们更深入地认识脑胶质瘤的发病机理,并可为该病的诊疗提供潜在的标记物及分子作用靶点。方法:应用癌症基因组图谱（TCGA）数据库比较人类正常脑组织与脑胶质瘤组织中CXCL1基因m RNA水平的差异;应用Kaplan-Meier生存分析脑胶质瘤患者CXCL1表达水平与其生存预后的关系;通过基因集富集分析（GSEA）探究CXCL1在脑胶质瘤中可能涉及的信号通路;采用CCK-8细胞增殖实验研究不同浓度重组CXCL1对大鼠C6脑胶质瘤细胞增殖活性的影响;采用Transwell细胞迁移实验研究不同浓度重组CXCL1对大鼠C6脑胶质瘤细胞迁移活性的影响;采用Western blot蛋白印记实验研究不同浓度重组CXCL1对大鼠C6脑胶质瘤细胞BAX和ERK蛋白表达的影响。结果:对CGGA数据库中样本分析显示,脑胶质瘤组织中的CXCL1 m RNA水平显着高于正常对照组织;Kaplan-Meier生存分析表明,高表达CXCL1的脑胶质瘤患者较低表达CXCL1的患者生存时间明显缩短;KEGG信号通路富集分析显示,CXCL1在细胞因子-细胞因子受体相互作用通路、细胞分子粘附通路、细胞凋亡通路、自然杀伤细胞介导的细胞毒性通路、Nod样受体通路和趋化因子信号通路上富集程度较高;C6细胞用不同浓度的重组CXCL1培养72 h后,CCK-8细胞增殖实验结果表明,与0ng/ml CXCL1处理组比较,5 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml、30 ng/ml和50 ng/ml重组CXCL1处理组的C6细胞增殖活性显着增强;C6细胞用不同浓度的重组CXCL1培养24 h后,Transwell细胞迁移实验结果表明,与0 ng/ml CXCL1处理组比较,10 ng/ml、20 ng/ml、30 ng/ml和50 ng/ml重组CXCL1处理组的C6细胞迁移活性显着增强;Western blot蛋白印记实验所示,与0 ng/ml CXCL1处理组比较,50 ng/ml重组CXCL1处理组的C6细胞BAX蛋白表达水平显着降低,而20 ng/ml和50 ng/ml重组CXCL1处理组的ERK显着升高。结论:CXCL1在人类脑胶质瘤组织中表达上调,且其高表达与脑胶质瘤患者的短期生存期有关;外源性重组CXCL1可经MAPK/ERK/BAX信号转导通路而参与大鼠C6脑胶质瘤细胞的恶性转化过程。
赵丽娇[2]（2021）在《芳香烃受体AHR的内源性配体ITE抗神经胶质瘤的作用机制研究》文中研究表明胶质母细胞瘤（Glioblastoma,GBM）是一种最常见的原发性中枢神经系统肿瘤,具有迅速切换迁移模式的特性,阻断GBM的侵袭极具挑战性,寻求能够阻断多种迁移模式的药物是亟待解决的问题。前期我们的研究发现一种内源性芳基烃受体（Aryl Hydrocarbon Receptor,AHR）激动剂,小分子2-（1H-吲哚-3-羰基）-噻唑-4-羧酸甲酯（2-（1H-indole-3-carbonyl）-thiazole-4-carboxylic acid methyl ester,ITE）,可以阻断神经胶质瘤细胞迁移,为确定介导ITE-AHR效应的基因,我们分析了数据库中可能与AHR调控的迁移相关基因。并将其与RNA-seq收集的ITE处理后的基因表达变化进行比较。从两个基因集的交集中选择了可能相关基因,以供进一步研究。MYH9是非肌肉肌球蛋白IIA（non-muscle myosin,NMIIA）的组成部分,我们发现可通过ITE治疗降低其蛋白的表达水平。当MYH9在神经胶质瘤细胞中过表达时,通过划痕实验发现其表达水平和细胞迁移能力之间具有良好的相关性。MYH9的过表达消除了ITE的迁移抑制作用,提示ITE-AHR通过抑制MYH9表达来抑制细胞迁移。MYH9对于3D密闭空间中的细胞迁移至关重要,ITE通过AHR影响MYH9的事实开辟了新的研发途径。胶质母细胞瘤作为一种缺乏T细胞浸润的“冷”肿瘤,其中色氨酸双加氧酶IDO/TDO产生的犬尿氨酸（Kynurenine,Kyn）通过与AHR结合起到免疫抑制作用。目前已经开发的AHR拮抗剂,可以激活IDO过表达的癌症模型中的免疫反应。据报道,AHR可以像肿瘤抑制剂一样阻断神经胶质瘤细胞的侵袭,如何在癌症中靶向AHR仍然是一个未知的问题。在本文中,我们报道了ITE与PD1抗体协同作用,通过减少髓样来源的抑制性细胞（myeloid derived suppressive cells,MDSC）浸润来激活免疫。ITE与PD1抗体联合显着增加了神经胶质瘤组织中CD3+CD8+和CD3+CD4+T细胞的百分比。免疫调节基因的基因表达谱显示,已知的MDSC诱导物IL11被显着下调,这在ITE与PD1抗体联合组的蛋白水平上得到了证实。ITE单独使用抑制体外培养的GL261细胞中IL11的表达,并抑制IL11诱导PBMC向MDSC分化。在ITE组中,抑制IL11下游Stat3的磷酸化。在这种原位小鼠神经胶质瘤模型中,观察到的IL11-STAT3抑制作用是ITE抑制MDSC浸润,激活免疫的机制之一,因为还可能有其它通路。
贾玉峰[3]（2021）在《以免疫分子PDCD4为靶点的抗抑郁药物的设计、制备及作用研究》文中指出研究背景抑郁症（Depression）是一种常见并且严重的神经障碍类疾病,临床表现为持续的情绪低落、思维迟缓和生活无意义感。而重症抑郁症患者甚至会产生自杀的倾向,严重危害人类健康。目前抑郁症的治疗主要以药物缓解为主,已有的抗抑郁药物（选择性5-羟色胺（5-hydroxytryptamine,5-HT）再摄取抑制剂、5-羟色胺-去甲肾上腺素（noradrenaline,NE）再摄取抑制剂）主要通过提升突触间隙兴奋性神经递质的浓度发挥抗抑郁作用。但普遍存在见效时间长、副作用大以及人群药物敏感性差异大等问题。因此,揭示新的抑郁症发病机制和寻找新靶标,对抗抑郁药物研发和疾病的治疗有重要价值。程序性细胞死亡因子4（programmed cell death 4,PDCD4）是一个重要的蛋白质翻译抑制因子。已有研究表明PDCD4直接或间接调控细胞约1/3蛋白的表达,参与细胞因子表达调控及细胞生长、代谢等多个过程。我们实验室长期从事PDCD4与疾病的关系和分子机制研究,已发现PDCD4可通过负向调控不同的靶分子参与肿瘤、脂质代谢（动脉粥样硬化和肥胖）等多种疾病的发生与发展。更重要的是最近我们意外发现PDCD4与抑郁症的发生密切相关:1)PDCD4在抑郁症病人海马脑区（hippocampus,HIP）高表达,慢性束缚应激（chronic restraint stress,CRS）诱导抑郁症时可上调小鼠HIP中PDCD4的表达;2)PDCD4敲除小鼠能够抵抗CRS诱导的抑郁样行为,而于HIP过表达PDCD4,小鼠可出现自发性抑郁样行为;3)分子机制探索中我们发现PDCD4主要通过结合蛋白质翻译起始因子4A（eukaryotic initiation factor4A,eIF4A）进而抑制脑源性神经营养因子（Brain-derived neurotrophic factor,BDNF）翻译的起始促进抑郁症的发展。这些结果表明PDCD4是诱导抑郁症发生的新基因,可能成为抗抑郁药物研发的新靶点并为新型抗抑郁药物的设计和研究奠定理论基础。本文的目的是在已有研究的基础上,以PDCD4为靶点、以PDCD4调控BDNF表达的分子机制为理论基础。利用小干扰RNA沉默PDCD4表达、利用干扰肽和小分子化合物干扰PDCD4与下游靶基因的相互作用。设计、筛选和制备相关药物并通过体外细胞模型和CRS诱导的小鼠抑郁模型,分析这些候选药物对PDCD4下游靶分子BDNF表达的影响以及在抑郁症治疗中的作用,为新型抗抑郁药物的研发奠定基础。本项目的研究内容包括以下三个方面:一、PDCD4特异性小干扰RNA制备、修饰及抗抑郁作用研究;二、PDCD4干扰多肽的筛选、制备及抗抑郁作用研究;三、PDCD4配体小分子的筛选及抗抑郁作用研究。研究方法一、PDCD4特异性小干扰RNA（siPdcd4）制备、修饰及抗抑郁作用研究1.PDCD4小干扰RNA的制备及其对神经细胞BDNF表达影响（1）筛选PDCD4的特异性小干扰RNA（siPdcd4）,转染细胞,采用RT-PCR和免疫印迹检测siPdcd4的沉默效率;（2）脂质体法将siPdcd4转染至神经细胞,24h后免疫印迹检测其对PDCD4下游靶基因BDNF表达的影响。2.探究PDCD4小干扰RNA对小胶质细胞炎性细胞因子表达的影响（1）脂质体法将siPdcd4转染至小胶质细胞,24h后添加LPS和ATP刺激,收取不同时间梯度的细胞培养上清和总RNA;（2）RT-PCR和ELISA检测siPdcd4对小胶质细胞炎性细胞因子（IL-6、IL-1β）表达的影响。3.siPdcd4神经靶向修饰和干扰效率检测（1）合成狂犬病毒糖蛋白靶向运输多肽（RVG-9dR）;（2）体外将Cy5荧光素标记的siPdcd4（Cy5-siPdcd4）进行神经靶向运输修饰（RVG/Cy5-siPdcd4）;（3）RVG/Cy5-siPdcd4处理神经细胞,高内涵成像检测红色荧光信号在细胞内的分布;（4）RVG/Cy5-siPdcd4处理神经细胞48h后,RT-PCR和免疫印迹检测神经细胞中PDCD4表达变化。4.神经细胞mTORC1失活时RVG/siPdcd4对BDNF表达的影响（1）mTORC1特异性抑制剂rapamycin阻断神经细胞mTORC1信号通路,免疫印记检测不同时间梯度BDNF和PDCD4表达的变化;（2）RVG/siPdcd4沉默神经细胞内源性PDCD4,24h后,添加rapamycin阻断mTORC1信号通路,免疫印迹检测RVG/siPdcd4对BDNF表达的影响。5.检测RVG/siPdcd4能否跨过血脑屏障靶向入脑及对PDCD4和BDNF表达的影响（1）将50μg RVG/Cy5-siPdcd4通过尾静脉注射至小鼠体内,6h、24h、48h、和72h分别通过小动物活体成像系统检测红色荧光在体内的分布;（2）RT-PCR和免疫印迹检测海马区和前额叶皮质PDCD4的沉默效率和BDNF表达变化;（3）RVG/siPdcd4浓度梯度实验,通过PDCD4的沉默效率和BDNF的表达变化确定体内实验最优RVG/siPdcd4使用浓度。6.行为学评价RVG/siPdcd4对CRS诱导的抑郁样行为的影响（1）慢性束缚应激诱导小鼠抑郁模型。将RVG/siPdcd4通过尾静脉注射至小鼠体内,RT-PCR检测海马区和前额叶皮质中PDCD4的沉默效率,免疫印迹和ELISA检测海马中BDNF表达的变化;（2）ELISA检测海马和外周血中炎性细胞因子表达的变化,明确RVG/siPdcd4对抑郁症炎性水平的影响;（3）脑组织进行高尔基染色,通过神经元树突棘密度评价神经突触可塑性的改变;（4）通过悬尾实验、强迫游泳实验和蔗糖水偏好实验评价RVG/siPdcd4对小鼠抑郁样行为的影响。二、PDCD4干扰多肽的筛选、制备及抗抑郁作用研究1.筛选特异性干扰PDCD4与eIF4A结合的氨基酸序列（1）构建 eIF4A-HA、PDCD4-FLAG 和 BDNF-GFP 过表达载体;（2）查阅文献和蛋白结构数据库找到PDCD4与eIF4A相互作用的关键氨基酸位点及主要作用结构域（氨基酸序列）;（3）利用分子克隆构建关键结构域（氨基酸序列）与GFP的融合蛋白表达载体;（4）通过免疫共沉淀和免疫印迹实验,筛选能够特异性干扰PDCD4与eIF4A结合并且上调BDNF的表达的结构域（氨基酸序列）;（5）将筛选的氨基酸序列与跨膜序列相偶联（N端）,合成相应的干扰多肽。2.干扰多肽对PDCD4与eIF4A结合的影响（1）免疫荧光实验检测干扰多肽的跨膜效率、细胞内稳定性以及与PDCD4蛋白的结合情况;（2）免疫共沉淀及双荧光分子互补实验,检测干扰多肽对PDCD4和eIF4A结合的影响。3.干扰多肽对BDNF表达的影响（1）将PDCD4-FLAG和BDNF-GFP共同过表达于HEK-293细胞,免疫印迹检测干扰多肽对BDNF表达的影响;（2）免疫印迹及ELISA实验检测干扰多肽对神经细胞BDNF表达的影响;（3）ELISA检测神经细胞培养上清中分泌性BDNF和炎性细胞因子表达的变化。4.神经细胞mTORC1失活时干扰多肽对BDNF表达的影响在原代海马神经元mTORC1信号通路完全阻断的情况下,免疫印迹检测干扰多肽对神经元内源性BDNF表达的影响。5.海马定点注射干扰多肽对CRS诱导的焦虑及抑郁样行为的影响（1）野生型4-6周龄C57BL/6J雄性小鼠,慢性束缚应激诱导抑郁模型;（2）根据小鼠冠状脑图谱,于海马脑区腹侧埋下微型给药管,免疫荧光检测干扰多肽在海马组织中的扩散情况;（3）于抑郁小鼠海马区定点注射干扰多肽,治疗完成后免疫印迹实验和ELISA检测BDNF表达的变化;（4）小鼠脑组织进行高尔基染色,统计分析海马神经元轴突树突棘密度,评价干扰多肽对神经突触可塑性的影响;（5）干扰多肽治疗结束后进行行为学检测,评价干扰多肽对小鼠焦虑及抑郁样行为的影响。三、PDCD4配体小分子的筛选及抗抑郁作用研究1.PDCD4配体小分子的筛选基于高斯过程的定量结构-活性关系回归预测（Gaussian process-based QSAR）在类药物生物源化合物文库中进行高通量虚拟筛选。根据与靶蛋白的主要结合位置,筛选在微摩尔水平上与PDCD4蛋白具有高或中等亲和力的小分子化合物。2.PDCD4配体小分子功能检测（1）免疫共沉淀实验检测PDCD4配体小分子对PDCD4与eIF4A结合的影响;（2）免疫印迹实验检测PDCD4配体小分子对神经细胞BDNF表达的影响;（3）将PDCD4-FALG和BDNF-GFP过表达载体共同转染至HEK-293细胞,免疫印迹检测PDCD4过表达时PDCD4配体小分子对BDNF表达的影响;（4）免疫印迹检测神经细胞mTORC1失活时PDCD4配体小分子对BDNF的表达影响。3.PDCD4配体小分子对CRS诱导的抑郁样行为的影响（1）慢性束缚应激诱导小鼠抑郁模型,将不同浓度的PDCD4配体小分子通过腹腔注射至小鼠体内。免疫印迹实验和ELISA检测抑郁小鼠海马和前额叶皮质BDNF表达的变化;（2）脑组织进行高尔基染色,通过神经元轴突树突棘密度评价神经突触可塑性的变化;（3）对小鼠进行行为学检测评价PDCD4配体小分子对抑郁样行为的影响。结果一、PDCD4特异性小干扰RNA制备、修饰及抗抑郁作用研究前期研究结果显示抑郁症患者海马区PDCD4表达升高,于海马区过表达PDCD4后野生型小鼠出现自发抑郁样行为。而PDCD4敲除小鼠则完全抵抗慢性束缚应激导致的抑郁行为的产生,提示PDCD4是治疗抑郁症的重要靶点。为此,本部分利用PDCD4小干扰RNA干扰中枢神经系统PDCD4的表达,研究其抑郁症的治疗效应。（一）siPdcd4干扰效率检测及其对PDCD4下游靶基因表达的影响（1）首先通过对PDCD4的mRNA核酸序列进行分析,从核酸数据库筛选、合成了 PDCD4小干扰RNA（siPdcd4）,并通过细胞学实验证明能有效沉默PDCD4的表达。（2）siPdcd4对BDNF表达的影响:通过脂质体法将siPdcd4转染至神经细胞,免疫印迹实验检测siPdcd4对下游靶基因BDNF表达的影响。结果显示siPdcd4沉默PDCD4后可明显上调神经细胞BDNF的表达。（3）siPdcd4对炎性细胞因子表达的影响:PDCD4不仅可抑制BDNF,而且可负向调控促炎性细胞因子的表达。因此,我们进一步探究siPdcd4对小胶质细胞炎性细胞因子表达的影响,结果显示siPdcd4能够明显抑制LPS和ATP刺激诱导的IL-6和IL-1β的表达。（二）siPdcd4神经细胞靶向修饰及特异性检测（1）siPdcd4神经细胞靶向修饰:为了解决siPdcd4静脉注射不能通过血脑屏障入脑的技术瓶颈,我们合成了嗜神经的狂犬病毒糖蛋白多肽（RVG-9dR）。已经证明RVG-9dR多肽的9个D-精氨酸通过电荷相吸与siPdcd4结合,能够对siPdcd4进行神经靶向修饰（RVG/siPdcd4）。另外,为了便于体内示踪,采用Cy5荧光素（红色）对siPdcd4进行了标记（Cy5-siPdcd4）,制备了既具有神经特异性又可示踪的RVG/Cy5-siPdcd4复合物。（2）RVG/siPdcd4神经细胞靶向的特异性检测:为了检测RVG-9dR修饰后的siPdcd4（RVG/siPdcd4）神经靶向特异性,我们用RVG/Cy5-siPdcd4分别去处理具有乙酰胆碱受体的神经细胞（SH-SY5Y、HT-22）和小胶质细胞（BV2）以及不表达乙酰胆碱受体的非神经细胞Hela。通过高内涵成像系统检测Cy5-siPdcd4在细胞的分布,结果显示,神经细胞SH-SY5Y、HT-22和BV2的细胞浆中均能够观察到带红色荧光的siPdcd4,而非神经细胞HeIa的细胞浆中无明显红色荧光信号。（3）沉默效率检测:RT-PCR和免疫印迹结果显示RVG/siPdcd4能够在转录和翻译水平沉默神经细胞SH-SY5Y、HT-22和BV2内源性PDCD4的表达,而对非神经细胞HeIa的PDCD4无明显沉默作用。以上结果表明,RVG-9dR多肽修饰的siPdcd4（RVG/siPdcd4）特异性进入神经细胞并且沉默PDCD4的表达。（三）RVG/siPdcd4逆转神经细胞mTORC1失活对BDNF的抑制作用我们前期机制研究发现,抑郁症时脑内PDCD4表达升高是由于mTORC1活性降低导致PDCD4磷酸化-泛素化降解途径受阻的结果。故我们用mTORC1特异性抑制剂rapamycin去抑制海马神经元细胞HT-22和小胶质细胞BV2的mTORC1活性,建立模拟抑郁小鼠脑内变化的细胞模型。我们发现与体内结果一致mTORC1被抑制后PDCD4出现累积,BDNF的表达受到明显抑制。在相同的实验体系下,我们发现RVG/siPdcd4能够逆转神经细胞mTORC1失活对BDNF的抑制作用。（四）RVG/siPdcd4能够跨过血脑屏障靶向入脑为了检测RVG-9dR能否携带siRNA跨过血脑屏障。我们将RVG/Cy5-siPdcd4通过尾静脉注射至小鼠体内,通过活体成像系统进行体内示踪。结果显示6h时RVG/Cy5-siPdcd4已经由外周输运至脑组织但是进入剂量较少,此时Cy5-siPdcd4主要存在于小鼠的腹部。而24h时RVG/Cy5-siPdcd4则主要聚集于脑内,腹部无明显荧光。48h时脑内红色荧光依然存在但是与24h相比明显减弱。72h时脑内无可检测到的红色荧光信号。上述结果提示RVG/Cy5-siPdcd4能够跨过血脑屏障靶向入脑并且具有良好的稳定性。与此同时,在RVG/siPdcd4注射48h后通过RT-PCR和免疫印迹实验检测了海马和前额叶皮质中BDNF的表达变化。结果显示RVG/siPdcd4注射至小鼠体内通过沉默海马和前额叶皮质中的PDCD4上调BDNF的表达。（五）静脉注射RVG/siPdcd4可治疗慢性束缚应激诱导的抑郁症为了探究RVG/siPdcd4对抑郁症的治疗效果,慢性束缚应激诱导小鼠抑郁模型。诱导成功后通过尾静脉注射RVG/siPdcd4进行抗抑郁治疗:（1）RT-PCR和免疫印迹实验结果显示,RVG/siPdcd4能有效沉默抑郁小鼠海马和前额叶皮质中的PDCD4、降低促炎性细胞因子IL-6和IL-1 β表达并显着提升BDNF的表达;（2）脑组织高尔基染色实验结果显示,RVG/siPdcd4可增加海马神经元轴突树突棘的密度,改善神经突触可塑性;（3）行为学检测结果表明,RVG/siPdcd4能够降低悬尾实验、强迫游泳实验小鼠的不动时间,增加抑郁小鼠的蔗糖水偏好指数。以上结果表明,RVG/siPdcd4通过沉默PDCD4、抑制促炎细胞因子IL-6和IL-1β的表达、上调BDNF的表达和修复神经突触可塑性治疗CRS诱导的抑郁症。二、PDCD4干扰多肽的筛选、制备及抗抑郁作用研究前期机制的探索发现PDCD4通过结合eIF4A进而抑制BDNF的翻译促进抑郁症的发展。提示,如果干扰PDCD4和eIF4A的结合将解除PDCD4对BDNF的抑制作用进而治疗抑郁症。因此本部分根据PDCD4和eIF4A结合的位点筛选能够干扰二者相互作用的干扰多肽并对其抗抑郁作用进行研究。（一）eIF4A结合PDCD4关键序列的筛选通过分析已有的研究结果我们发现eIF4A的P56、K83、G137、T159和R360是eIF4A与PDCD4结合的关键氨基酸位点。根据氨基酸位点所在位置我们设计了4段可能结合PDCD4的序列,分别命名为eIF4A-Q、eIF4A-I、eIF4A-Ia和eIF4A-VI。为了验证各个氨基酸序列的功能,我们构建了 eIF4A-Q、eIF4A-I、eIF4A-Ia和eIF4A-VI与GFP的融合蛋白表达载体,采用免疫共沉淀和免疫印迹实验确定这些基序对PDCD4与eIF4A结合的影响。结果显示,eIF4A-VI干扰PDCD4与eIF4A结合的能力最强,并且能明显上调BDNF的表达。而eIF4A-Q、eIF4A-l和eIF4A-la虽然能够干扰PDCD4与eIF4A的结合,但是对BDNF的表达有明显的抑制作用。因此,eIF4A-VI成为后续研究的候选序列。（二）eIF4A-VI的跨膜修饰及其对PDCD4与eIF4A结合的影响由于PDCD4与eIF4A的结合主要发生于细胞浆内。为了使筛选的序列进入细胞发挥作用,将具有跨膜效应的9个精氨酸（9 Arginine）偶联在eIF4A-VI的N端,合成了具有跨膜特性的9R-eIF4A-VI干扰多肽。另外,为了证明9R-eIF4A-VI干扰多肽的特异性,我们将363号氨基酸由R363突变为Q363合成了突变多肽Mu-9R-eIF4A-VI作为对照。免疫荧光结果表明,干扰多肽能在1h内跨过细胞膜进入细胞浆并在细胞内能够稳定存在48h,进一步研究发现9R-eIF4A-VI干扰多肽与PDCD4蛋白存在明显的共定位。与此同时,免疫共沉淀与双荧光分子互补实验结果表明9R-eIF4A-VI干扰多肽能够显着干扰PDCD4与eIF4A的结合,但相同的突变多肽Mu-9R-eIF4A-VI却无此效应。以上结果表明9R-eIF4A-VI干扰多肽通过靶向PDCD4特异性干扰PDCD4与eIF4A的结合。（三）干扰多肽特异性上调BDNF的表达将PDCD4-FLAG和BDNF-GFP过表达载体按照3:1的质量比共转染于HEK-293细胞,6h后添加9R-eIF4A-VI干扰多肽,免疫印迹实验检测BDNF表达的变化。结果表明,9R-eIF4A-VI干扰多肽能够逆转PDCD4过表达对BDNF的抑制作用,但相同浓度的Mu-9R-eIF4A-VI多肽对BDNF表达的上调作用消失。为了明确干扰多肽对神经细胞内源性BDNF表达的影响。不同浓度的9R-eIF4A-VI干扰多肽处理神经细胞（原代海马神经元、小鼠海马神经元细胞HT-22和小胶质BV2）。免疫印迹结果表明9R-eIF4A-VI干扰多肽能够显着上调神经细胞内源性BDNF的表达。与此同时,通过炎性细胞因子的表达水平评价了 9R-eIF4A-VI干扰多肽对神经细胞的副反应。ELlSA结果显示,9R-eIF4A-VI干扰多肽并不会诱发炎性相关细胞因子lL-6和IL-10表达上调。（四）干扰多肽逆转海马神经元mTORC1失活对BDNF的抑制作用在前期的工作中,我们在海马神经细胞系和小胶质细胞中用mTORC1活性抑制剂成功构建了模拟抑郁小鼠脑内变化的细胞模型。为了探究9R-eIF4A-VI干扰多肽对神经元BDNF表达的影响,我们用rapamycin去抑制原代海马神经元mTORC1的活性。我们发现与前期结果一致,mTORC1失活后PDCD4出现累积,BDNF的表达受到明显抑制。而9R-eIF4A-VI干扰多肽能够逆转原代海马神经元mTORC1失活对BDNF的抑制作用。（五）海马区注射干扰多肽能够缓解CRS诱导的焦虑和抑郁样行为为了检测9R-eIF4A-VI干扰多肽对焦虑和抑郁样行为的影响。通过CRS诱导小鼠抑郁模型,模型构建成功后,通过脑立体定位将9R-eIF4A-VI干扰多肽定点注射至抑郁小鼠的海马区:（1）脑组织免疫荧光结果显示干扰多肽能够通过定位注射扩散至整个海马组织;（2）免疫印迹实验和ELISA结果显示干扰多肽能够显着上调抑郁小鼠海马中BDNF的表达;（3）脑组织高尔基染色结果表明干扰多肽通过增加神经元突触棘密度,改善神经突触可塑性;（4）行为学结果显示,干扰多肽治疗组小鼠在悬尾实验、强迫游泳实验中与CRS组相比不动时间明显减少。蔗糖水偏好实验中干扰多肽治疗组小鼠蔗糖水偏好指数明显高于CRS组。旷场实验和高架十字实验干扰多肽治疗组小鼠中央区的停留时间显着低于CRS组。以上结果表明,海马区定点注射9R-eIF4A-VI干扰多肽通过上调BDNF表达、改善神经突触可塑性,缓解CRS诱导的焦虑和抑郁样行为。三、PDCD4配体小分子的筛选及抗抑郁作用研究尽管干扰多肽和siRNA药物有特异性高、免疫原性低等优势,但制备成本高、不能口服用药,将来临床应用会受到一定限制。为了克服这种不足,在本部分研究工作中,我们主要探索PDCD4配体小分子化合物治疗抑郁症的可行性（一）PDCD4配体小分子的筛选已有研究报道,通过高通量虚拟筛选从类药物小分子文库中筛选了 6种可能与PDCD4结合的小分子化合物。进一步研究发现,一种小分子化合物与PDCD4具有高亲和力,另一种小分子与PDCD4具有中等亲和力。模拟结果显示这两种化合物主要通过氢键和π-π键与PDCD4 C端MA-3结构域的氨基酸相连接,但是结合后的功能尚不清楚。故本课题选择这两种小分子为候选化合物（分别命名为ZHJ-204和ZHJ-690）检测其对PDCD4靶分子BDNF表达的影响。（二）PDCD4配体小分子对BDNF表达的影响（1）首先,我们检测了小分子ZHJ-204和ZHJ-690对神经细胞内源性BDNF表达的影响,结果显示10pM至1nM的ZHJ-204和ZHJ-690能显着上调HT-22和BV2 BDNF的表达,并且具有浓度依赖性;（2）神经细胞mTORC1失活体外抑郁模型结果表明,ZHJ-204和ZHJ-690能够解除rapamycin对BDNF的抑制作用,而且小分子ZHJ-204相较于ZHJ-690对BDNF的上调作用更为显着;（3）在PDCD4过表达模型中,我们发现小分子ZHJ-204和ZHJ-690能够逆转PDCD4过表达对BDNF的抑制作用。以上结果表明,PDCD4配体小分子ZHJ-204和ZHJ-690能够上调BDNF的表达。（三）PDCD4配体小分子抗抑郁作用研究通过CRS诱导小鼠抑郁模型,诱导完成后进行配体小分子的干预治疗。我们将不同浓度的配体小分子通过腹腔注射至小鼠体内,对照组注射等量的生理盐水,每天注射一次共10次,治疗完成后进行抑郁行为学评价和脑组织生化标志物分析。（1）首先,我们检测了抑郁症相关脑区海马和前额叶皮质中BDNF表达的变化。免疫印迹结果显示,持续的CRS能够降低海马和前额叶皮质中BDNF的含量,而ZHJ-204（5mg/kg）的治疗能够显着上调抑郁小鼠海马和前额叶皮质中BDNF的表达。（2）行为学结果表明,ZHJ-204（5mg/kg）治疗组小鼠在悬尾实验和强迫游泳实验中不动时间与CRS组相比显着降低。蔗糖水偏好实验结果显示ZHJ-204（5mg/kg）治疗组小鼠蔗糖水偏好指数明显高于CRS组。以上结果表明,腹腔注射PDCD4配体小分子ZHJ-204通过上调BDNF的表达缓解CRS诱导的抑郁样行为。结论1.神经靶向修饰的PDCD4小干扰RNA（RVG/siPdcd4）通过特异性沉默PDCD4、抑制促炎性细胞因子表达、上调BDNF表达、改善神经突触可塑性治疗CRS诱导的抑郁症。2.海马定位注射特异性干扰PDCD4与eIF4A结合的9R-eIF4A-VI干扰多肽,通过上调BDNF的表达缓解CRS诱导的焦虑和抑郁样行为。3.腹腔注射PDCD4配体小分子ZHJ-204通过上调海马和前额叶皮质中BDNF的表达缓解CRS诱导的抑郁样行为。创新性及意义1.我们首次将小核酸药物用于抑郁症的治疗,并且通过体外修饰解决了 siRNA神经靶向问题。并且发现经过脑内靶向修饰的siPdcd4（RVG/siPdcd4）通过静脉注射能够缓解CRS诱导的抑郁样行为,RVG/siPdcd4有可能成为新的抗抑郁药物。2.在多肽类抗抑郁药物的研究中,我们筛选并设计了能特异性干扰PDCD4与eIF4A结合的9R-eIF4A-VI干扰多肽。体内实验证明海马定点注射9R-eIF4A-VI干扰多肽能够缓解CRS诱导的焦虑和抑郁样行为。进一步证明了 PDCD4促进抑郁症的分子机制并为抗抑郁药物的研究提供了新的策略,同时为干扰多肽类的抗抑郁药物的研发奠定了基础。3.在小分子类抗抑郁药的研究中,我们从类药物小分子文库中筛选了 PDCD4的配体小分子,并且证明了腹腔注射PDCD4配体小分子ZHJ-204通过上调BDNF的表达缓解CRS诱导的抑郁样行为。我们的工作为研究新型小分子抗抑郁药物提供了前期工作基础。局限性1.RVG/siPdcd4药代动力学,药物安全评价等相关研究尚未完成。2.尽管脑内注射9R-eIF4A-VI干扰多肽显现出明显的抗抑郁效应,但外周用药的修饰和效应尚需进一步研究。3.虽然已经证明PDCD4配体小分子有一定抗抑郁作用,但仍需要对小分子化合物进行进一步的改造和修饰,以便提高其活性和成药性。
罗小彬[4]（2021）在《整合生物信息学分析发现免疫相关基因C5AR1可能是胶质瘤潜在的预后标志物》文中进行了进一步梳理目的:免疫相关基因在肿瘤的发生发展过程中发挥了重要作用,所以我们的研究目的是发现与脑胶质瘤患者预后有关的免疫相关基因,并探索与免疫相关基因有关的脑胶质瘤肿瘤微环境中免疫细胞的浸润情况。方法:首先,下载中国脑胶质瘤基因组图谱计划（Chinese Glioma Genome Atlas,CGGA）数据库中脑胶质瘤样本的表达谱（m RNAseq）数据,由于其被分为了两个批次,所以需要对其进行标准化和批次校正。然后再筛选出其中的原发性胶质瘤样本进行后续分析。其次,使用ESTIMATE算法对原发性胶质瘤样本进行基质评分和免疫评分,并对其进行差异分析,然后把基质评分和免疫评分的差异表达基因和Immport数据库中的免疫基因取交集,得到共同的免疫相关基因（Immune Related Genes,IRGs）,再进行功能富集分析。此外,我们使用了IRGs构建蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-Protein Interaction,PPI）网络,并从中筛选出前30个连接度（Degree）高的基因。我们通过Pubmed数据库对PPI中连接度最高的前30个基因进行筛选,筛选出在胶质瘤中未被深入研究的IRGs,并进行差异表达分析、生存分析、与肿瘤分期的关系、单基因的基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis,GSEA）、独立预后因素分析、受试者工作特征曲线（Receiver Operating Characteristic,ROC）预测靶基因的灵敏度和特异度等多种生物信息学分析。另外,我们还对靶基因进行免疫相关通路及Hallmark、京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）通路富集分析。最后,我们使用CIBERSORT算法对原发性胶质瘤的表达矩阵进行22种免疫细胞含量的估算,并分析了靶基因的表达和免疫细胞的关系,以及靶基因和免疫细胞的相关性分析。重要的是,我们还对免疫细胞进行了生存分析。结果:基质评分共发现915个差异表达基因（上调基因695个,下调基因220个）;免疫评分共发现991个差异表达基因（上调基因614个,下调基因377个）;然后将上述差异基因与Immport免疫数据库取交集,结果共获得118个IRGs。经过Pub Med对PPI连接度中前30个基因的筛选,我们发现只有C5AR1基因在胶质瘤中未被深入研究。因此,我们选择C5AR1基因进行后续分析。整合生物信息学研究发现C5AR1基因在低级别胶质瘤、胶质母细胞瘤和正常脑组织中差异表达（P<0.05）。生存分析的结果显示C5AR1基因可以显着降低低级别胶质瘤（WHOⅡ级）、高级别胶质瘤（WHOⅢ级和WHOⅣ级）患者的总体生存率（P<0.05）。并且C5AR1基因的表达和胶质瘤的分级成正比,随着肿瘤分级的升高,基因的表达也随之升高（P<0.05）。单基因GSEA分析发现C5AR1基因在Hallmark通路上主要富集在多条与胶质瘤发生、发展的通路上,如P53 pathway（P53通路）,PI3K/AKT/MTOR signaling（PI3K/AKT/MTOR信号通路）,Angiogenesis（血管生成通路）等。在KEGG通路上主要富集在VEGF signaling pathway（血管内皮生长因子信号通路）,P53 signaling pathway（P53信号通路）,Pathways In Cancer（癌症途径信号通路）,JAK/STAT signaling pathway（JAK/STAT信号通路）等。独立预后分析表明C5AR1基因可以作为脑胶质瘤的独立的预后因子（P<0.05）,并且ROC曲线的曲线下面积（Area Under The Curve,AUC）为0.71,亦支持其可以作为胶质瘤的靶基因和治疗靶点。此外,肿瘤微环境分析发现靶基因的表达与嗜中性粒细胞（Neutrophil）有关（P<0.05）。重要的是,相关性分析也提示靶基因的表达和嗜中性粒细胞有关（P<0.05）,生存分析表明靶基因的高表达可以显着降低胶质瘤患者的总体生存率（P<0.05）。结论:整合生物信息学分析发现C5AR1基因在正常脑组织和原发性胶质瘤中差异表达,并和原发性胶质瘤的分期及原发性胶质瘤患者的总体生存率有关。此外,C5AR1基因的高表达还通过多条生物学途径参与原发性胶质瘤的发生和进展。并且它还可以作为原发性胶质瘤疾病的独立预后因子,用于评估原发性胶质瘤患者的预后。通过对原发性胶质瘤免疫微环境的分析,发现C5AR1基因的表达和嗜中性粒细胞（Neutrophil）有关,并且在原发性胶质瘤患者中嗜中性粒细胞表达越高,患者的总体生存率也就越低。
刘婕婷[5]（2021）在《胶质母细胞瘤诊断预后标记物筛选及其验证的实验研究》文中提出目的胶质瘤是中枢神经系统最常见的肿瘤,而WHO IV级的胶质母细胞瘤（glioblastoma multiforme,GBM）又是胶质瘤中最高发的类型。70%-80%的胶质母细胞瘤患者病程介于3-6个月,其5年生存率不到10%。尽管近年来显微外科手术+局部精准放疗+术后靶基因治疗的综合治疗模式已在很大程度上改善了患者的预后,但由于肿瘤高度的增殖能力、浸润性生长、化疗药物“替莫唑胺”的早期耐受、微血管增生以及相关致病基因突变等多种因素的影响,患者的预后仍然较差。研究发现,肿瘤组织基因型的差异,会对患者的预后产生不同的影响。2016年WHO已将IDH突变、1p/19q缺失、MGMT启动子甲基化等肿瘤的分子病理学特征更精确地用于胶质瘤的分级分类中,因此,胶质瘤基因标记物的研究为细化其分子诊断并改善患者预后提供了新的药物靶点选择。基于此,本研究通过文献计量学方法可视化胶质母细胞瘤基因标记物研究的现状及热点,通过生物信息学方法筛选东、西方人均适用的胶质母细胞瘤诊断及预后标记物,最后通过分子生物学方法验证筛选标记物的表达情况,探索影响胶质瘤细胞生存的生物学机制以及与患者预后的相关性,以期为临床诊疗提供理论依据。方法（1）文献计量学分析:检索主要数据库,获取胶质母细胞瘤基因标记物研究文献,根据纳入排除标准筛选文献,利用书目共现系统分析软件（Bibliographic Item Co-Occurrence Mining System,BICOMS）对纳入研究的关键词、作者、国家和地区、研究机构、发表时间和期刊等信息进行提取和整理,对作者、研究机构、国家和地区及关键词生成合作网络图和聚类网络图,整理差异表达基因的HR值及95%CI。（2）生物信息学分析:从TCGA（The Cancer Genome Atlas）数据库得到GBM患者样本的表型信息、基因表达、生存数据,从GTEx（The Genotype-Tissue Expression）数据库筛选正常样本的表型信息和基因表达数据,并进行标准化。从CGGA（Chinese glioma genome atlas）数据库下载693和325数据集中患者信息。利用差异表达分析、单变量Cox比例风险回归和LASSO（least absolute shrinkage and selection operator）方法筛选GBM患者预后相关基因,计算预后指数（prognosis index,PI）,创建K-M（Kaplan-Meier）生存曲线和ROC（the time-dependent receiver operating characteristic）曲线分析PI模型的预测效果。通过多变量Cox比例风险回归比较预后指数与其他临床因素的预后价值。利用GO（Gene ontology）基因功能分析和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）富集分析预后基因的生物学功能。通过单变量、多变量Cox比例风险回归、K-M曲线和ROC曲线分析,将在TCGA中筛选的预后相关基因在CGGA＿325和CGGA＿693数据集中验证。（3）实验室检测:q RT-PCR（实时荧光定量PCR）、Western Blot、免疫组织化学检测各级别胶质瘤患者肿瘤组织和正常脑组织中筛选的预后相关基因表达量;沉默A172胶质瘤细胞株的FN1、HSPA5基因;MTT、流式细胞术和Transwell小室迁移实验分别检测沉默FN1、HSPA5基因对A172胶质瘤细胞株增殖、凋亡和迁移的影响;q RT-PCR与Western blot检测沉默FN1、HSPA5基因对A172胶质瘤细胞株Bax、Bcl-2、MMP9和Ecadherin表达的影响。随访胶质母细胞瘤患者的PFS（Progression-Free Survival）和OS（Overall Survival）,通过单变量、多变量Cox比例风险回归、K-M曲线分析基因表达差异对患者预后的影响,并分析基因差异表达与患者临床病理参数的相关性。结果（1）胶质母细胞瘤基因标记物研究现状和热点:最终纳入1771篇文献,中文123篇,中文研究数量不到外文的1/10。26个省市的116个机构参与了中文文献研究,18个国家的611个机构参与了外文文献研究,省份、国家和机构之间合作有待进一步加强。中文文献239个关键词聚类分析得到5个类别,外文文献2963个关键词聚类分析得到4个类别。中文文献关注的基因标记物中,基于细胞和组织共同关注的有2-HG、CD133、CXCR4、Vimentin、Nestin等。外文文献关注的基因标记物中,组织关注的有271个,细胞关注的有87个,基于数据库的生信关注有900个。细胞、组织和生信共同关注的有VEGF、TGFBI、CD44、COL1A2、COL3A1等。同时,外文文献关注的微小RNA有310个。中文文献关注的信号通路有MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路、P53信号通路和Fas/Fas L信号通路。外文文献关注的信号通路有Wnt/β-catenin信号通路、Akt/ERK信号通路、Akt/Fox M1信号通路、ATM/Chk2/p53信号通路、CDK4/6-RB信号通路等。（2）胶质母细胞瘤诊断、预后标记物筛选:按阈值模型,差异表达的基因保留了581个。其中138个高表达,443个低表达,最终筛选出20个m RNAs。其中16个m RNAs（RNF10、MTPN、RTN4、HSPA5、PLD3、GRN、FLII、NDUFB2、DKK3、MAP1LC3A、SERPINE2、TTYH3、SCG5、FN1、TAGLN2、LY6E）为原癌基因,HRs为1.230～2.039,4个m RNAs为抑癌基因（RPS19、EIF3L、EIF4A2、FDPS）,HRs为0.789～0.552。PI的HR为2.653（95%CI 1.976-4.122）（P<0.05）。PI的K-M曲线结果显示,3年和5年的AUC分别为0.824和0.820。差异表达的基因参与8个生物学过程,分别是细胞粘附分子锚定、分子伴侣结合、泛素蛋白连接酶结合、泛素样蛋白连接酶结合、钙粘蛋白结合、翻译起始因子活性、翻译因子活性RNA结合和未折叠蛋白结合。TCGA筛选的20个m RNAs在CGGA的单变量Cox结果表明,4个基因（MTPN、RTN4、MAP1LC3A和DKK3）与OS的相关性不显着,7个基因（LY6E、FLII、PLD3、EIF4A2、RNF10、RPS19和NDUFB2）仅在CGGA＿325中具有统计学意义。其他9个基因（TTYH3、TAGLN2、FN1、HSPA5、EI3L、SCG5、SERPINE2、FDPS和GRN）在CGGA＿693和CGGA＿325中对预后均具有预测效应。SCG5和SERPINE2在CGGA和TCGA中表现出相反的作用,7个基因（TTYH3、TAGLN2、FN1、HSPA5、EI3L、FDPS和GRN）在TCGA和CGGA之间表现出相同的效应（原癌基因或抑癌基因）。20个m RNAs在CGGA的多因素Cox回归分析显示,考虑到其他临床混杂因素,PI仍然是关键预后预测因子。（3）胶质母细胞瘤诊断、预后标记物的实验验证:q RT-PCR与Western blot结果显示,与正常脑组织相比,胶质瘤组织中FN1、GRN、HSPA5、TTYH3、TAGLN2基因m RNA和蛋白表达量显着升高（P<0.05）,并且随着WHO分级的升高,m RNA和蛋白表达量逐渐升高;免疫组化的结果也显示,与正常脑组织相比,胶质瘤组织中FN1、GRN、HSPA5、TTYH3、TAGLN2蛋白的阳性表达率显着升高（P<0.05）,随着WHO分级的升高,阳性表达率逐渐升高。在A172细胞株中,与sh FN1-NC（negative control）组和sh HSPA5-NC组相比,sh FN1组、sh HSPA5组细胞24h、48h和72h的增殖率显着降低（P<0.05）、48h的凋亡率显着升高（P<0.05）、48h的迁移细胞数显着降低（P<0.05）,Bax、Ecadherin m RNA、蛋白的表达量显着升高（P<0.05）,Bcl-2和MMP9的m RNA、蛋白表达量显着减少（P<0.05）。与空白组相比,sh FN1-NC组和sh HSPA5-NC组细胞各指标均无显着变化。影响GBM患者PFS的单变量回归分析显示,FN1、HSPA5、TAGLN2、GRN阳性表达组患者PFS中位生存时间和平均生存时间显着降低（P<0.05）;多变量回归分析结果显示,FN1、HSPA5和TAGLN2的表达对GBM患者PFS具有独立影响。影响GBM患者OS的单变量回归分析显示,FN1、HSPA5、TAGLN2、GRN阳性表达患者的OS中位生存时间和平均生存时间显着降低（P<0.05）;多变量回归分析结果显示,FN1、HSPA5、GRN、TAGLN2表达对GBM患者OS具有独立影响（P<0.05）。结论（1）胶质母细胞瘤基因标记物研究的中文文献数量较少,外文文献数量相对较多,但是中外文研究的作者、研究机构和国家的合作还有很大的空间。中文研究主题相对分散,外文研究主题比较集中,但均有拓展的空间,在开展基因标记物组织和细胞研究的同时,更应该关注基因标记物对胶质母细胞瘤患者预后的影响。（2）通过生物信息学分析,20个基因与患者预后相关,分别为RNF10、MTPN、RTN4、HSPA5、PLD3、GRN、FLII、NDUFB2、DKK3、MAP1LC3A、SERPINE2、TTYH3、SCG5、FN1、TAGLN2、LY6E、RPS19、EIF3L、EIF4A2、FDPS。主要参与细胞粘附分子结合、伴侣结合、泛素蛋白连接酶结合等生物学功能,涉及肿瘤的增殖、侵袭、迁移等机制,由其建立的PI预测模型既可有效地预测TCGA中GBM的发病风险,也可预测中国GBM患者的发病风险。（3）20个基因中,在TCGA和CGGA数据库中具有相同表达趋势,且对GBM表现出相同效应的基因有7个,分别为TTYH3、TAGLN2、FN1、HSPA5、EI3L、FDPS和GRN,其中TTYH3、TAGLN2、FN1、HSPA5、GRN为原癌基因,EI3L、FDPS为抑癌基因。这7个基因是东、西方人均适用的胶质母细胞瘤诊断、预后标记物。（4）FN1、GRN、HSPA5、TTYH3、TAGLN2在胶质瘤组织的高表达可能对胶质瘤的发生发展具有促进作用,FN1、HSPA5的高表达,通过增强肿瘤细胞增殖、抑制凋亡、促进转移,影响其生物学行为,从而促进胶质瘤的进展。（5）FN1、HSPA5、TAGLN2、GRN的高表达,影响胶质母细胞瘤患者的无进展生存期和总生存期,且与胶质母细胞瘤患者的预后呈负相关,可作为胶质母细胞瘤诊断、预后双重标记物,为临床诊疗探索新的治疗靶点提供参考。
薛晶[6]（2021）在《基于TMT蛋白质组学的差异蛋白PP1γ在胶质瘤中的作用及机制研究》文中提出目的:通过探索胶质瘤差异表达蛋白,了解差异表达蛋白的生物学功能及相互作用网络,筛选调控重要信号通路的关键因子,研究关键差异蛋白在胶质瘤中的作用及其分子机制,为改善胶质瘤预后提供新的治疗靶点奠定理论基础。方法:1)选择5对胶质母细胞瘤（Glioblastoma,GBM）及手术路径非肿瘤脑组织,应用串联质谱标签（Tandem mass tags,TMT）蛋白质组学技术筛选差异表达的蛋白质,通过GO分析、IPA（Ingenuity Pathway Analysis）生物分析平台、KEGG、PPI及GEPIA分析等生物信息学方法,探索差异表达蛋白的主要功能、蛋白互作网络、上游调控因子、参与的信号通路及预后意义,筛选出调控重要信号通路的关键因子;2)选择低级别胶质瘤（Low grade glioma,LGG）和GBM石蜡包埋组织样本制作组织芯片,利用免疫组织化学技术在组织芯片中检测差异蛋白PP1γ的表达及其与临床病理特征及预后之间的关系;在LGG中通过Sanger测序技术检测异柠檬酸脱氢酶1（Isocitrate dehydrogenase 1,IDH1）突变,并通过荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ hybridization,FISH）检测1p19q共缺失,分析不同分子分型中PP1γ表达水平的差异;3)构建PP1γ稳定低表达细胞株,研究PP1γ沉默对GBM细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期及侵袭和迁移能力的影响;观察PP1γ沉默对Yes相关蛋白1（Yes-associated protein1,YAP1）磷酸化水平、YAP1在胞核/胞浆中的定位和表达量及对干细胞多潜能标记物Sox2,Oct4和Nanog表达水平的影响;分析PP1γ沉默对干细胞标志物CD133阳性率、细胞悬浮球形成能力及替莫唑胺（Temozolomide,TMZ）药物敏感性的影响。结果:1)根据TMT蛋白质组学共鉴定出2458个差异表达蛋白质,包括1398个上调的差异表达蛋白和1060个下调的差异表达蛋白,结合生物信息学分析及文献报道,Hippo/YAP1信号通路是差异表达蛋白显着富集的重要信号通路,PP1γ是上调的差异表达蛋白并处于Hippo/YAP1信号通路的关键位点;2)PP1γ在胶质瘤组织中高表达,PP1γ表达与WHO分级、Ki-67、YAP1和Sox2的表达呈正相关,在LGG中PP1γ在IDH1突变型中低表达,PP1γ高表达是胶质瘤预后差的独立影响因素;3)PP1γ沉默抑制了胶质瘤细胞增殖、促进了细胞凋亡、使细胞阻滞于G0/G1期并抑制了细胞侵袭和迁移的能力;PP1γ沉默使YAP1磷酸化水平升高,增加了YAP1在胞浆中的表达,降低了YAP1在胞核中的表达,并抑制了干细胞多潜能标记物Sox2,Oct4和Nanog的表达;PP1γ沉默降低了干细胞标记物CD133阳性细胞比例,抑制了细胞悬浮球形成能力,增强了胶质瘤细胞对TMZ药物处理的敏感性。结论:PP1γ是GBM中上调的关键差异表达蛋白,PP1γ高表达与胶质瘤恶性程度高及预后不良相关,PP1γ主要通过YAP1/Sox2途径调控胶质瘤细胞增殖、侵袭、GSCs干性特征维持及TMZ药物敏感性。PP1γ可能成为新的胶质瘤靶向治疗的重要因子。
陈晓彤[7]（2021）在《PDCD4通过eIF4A依赖的方式抑制TFEB翻译并负向调控溶酶体功能和巨噬细胞抗肿瘤能力》文中研究指明研究目的转录因子EB（TFEB）是调控溶酶体发生和溶酶体功能的关键转录因子,能够参与调控90%的溶酶体相关基因的表达,在调控溶酶体方面起着总体协调的重要作用。TFEB的相关研究在近十年成为研究热点,靶向TFEB治疗溶酶体储积症、溶酶体功能异常相关疾病和神经退行性疾病已经得到广泛证实。但是TFEB在肿瘤、肿瘤相关免疫细胞和肿瘤免疫治疗中的作用尚不清楚。目前关于TFEB的调控机制研究主要集中在其磷酸化和去磷酸化调控机制以及亚细胞定位调控方面,对于TFEB本身的转录和翻译的研究尚未见报道。程序性死亡因子4（PDCD4）是我们课题组长期关注的抑癌基因和蛋白质翻译抑制分子。在多数肿瘤细胞中,PDCD4表达下调或缺失;回补或过表达PDCD4能够抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力。在抑制蛋白质翻译方面,PDCD4能够通过eIF4A依赖和eIF4A非依赖的方式分别抑制翻译的起始和延伸过程,最终抑制蛋白质表达。我们已经发表的文章发现,PDCD4基因敲除抑制小鼠巨噬细胞泡沫化,促进巨噬细胞中的脂质代谢;PDCD4抑制自噬相关基因ATG5的表达,机制上PDCD4通过eIF4A依赖的方式抑制ATG5蛋白质翻译,敲除PDCD4能够促进ATG5表达,提高细胞自噬水平。然而,PDCD4能否参与调控溶酶体功能尚不清楚,有待实验探究。本研究旨在通过体内外实验明确PDCD4是否参与调控溶酶体发生和溶酶体功能,进一步探究其相关调控机制。探究PDCD4是否调控TFEB的转录或者翻译过程。为完善TFEB的调控网络,提供重要理论基础;为改善溶酶体功能,治疗溶酶体相关疾病、神经退行性疾病和肿瘤提供新的思路。研究方法一.PDCD4通过TFEB调控溶酶体发生和溶酶体功能1.溶酶体形态和数目检测:使用免疫荧光技术染色溶酶体标志性蛋白,分别检测PDCD4敲除或过表达后小鼠巨噬细胞和胚胎成纤维细胞中溶酶体的形态、大小和数目。2.溶酶体活性检测:使用流式细胞术染色溶酶体特异性活性探针,检测PDCD4敲除或过表达对小鼠巨噬细胞和胚胎成纤维细胞中溶酶体活性的调控。3.溶酶体相关蛋白表达检测:使用免疫蛋白印迹技术,检测PDCD4敲除或过表达后小鼠巨噬细胞和胚胎成纤维细胞中溶酶体相关膜蛋白和溶酶体酶的表达情况。4.PDCD4通过TFEB调控溶酶体:分别在PDCD4敲除的小鼠巨噬细胞和胚胎成纤维细胞中,干扰TFEB表达,使用免疫荧光、流式细胞术和免疫蛋白印迹分别检测溶酶体形态大小、数目、活性和溶酶体相关蛋白表达情况;使用实时定量PCR技术检测PDCD4敲除和过表达,以及干扰TFEB表达后,TFEB调控的一系列下游基因的表达情况。二.PDCD4调控TFEB细胞核定位的分子机制1.TFEB活性和亚细胞定位检测:活性的TFEB能够进入细胞核发挥其转录调控作用。在PDCD4敲除或过表达的小鼠巨噬细胞和胚胎成纤维细胞中,分离细胞浆和细胞核蛋白,使用免疫蛋白印迹检测TFEB在细胞浆和细胞核中表达情况;使用免疫荧光技术,特异性染色TFEB,检测其亚细胞定位情况。2.TFEB细胞核定位是否依赖于mTORC1活性:在PDCD4敲除或过表达的小鼠巨噬细胞和胚胎成纤维细胞中,分别使用EBSS饥饿或mTORC1特异性抑制剂来抑制mTORC1活性,通过免疫蛋白印迹和免疫荧光,检测TFEB在细胞浆和细胞核中的表达情况;同时检测PDCD4表达变化过程中,mTORC1活性情况;以干扰TFEB组为对照。3.TFEB细胞核定位是否依赖于ERK2活性:在PDCD4敲除的小鼠巨噬细胞和胚胎成纤维细胞中,使用免疫蛋白印迹检测ERK2活性情况。三.PDCD4调控TFEB表达的分子机制1.检测PDCD4对TFEB mRNA水平的影响:在多种细胞系中,敲除、干扰或梯度过表达PDCD4,使用实时定量PCR技术,检测PDCD4表达变化对TFEB mRNA表达水平的影响。2.检测PDCD4对TFEB蛋白水平的调控:在多种细胞系中,敲除、干扰或梯度过表达PDCD4,使用免疫蛋白印迹,检测PDCD4表达变化对TFEB蛋白水平的影响。3.检测PDCD4对TFEB降解和稳定性的调控:使用PDCD4基因敲除体系,通过免疫蛋白印迹,检测MG132阻断蛋白质降解途径和CHX阻断蛋白质合成途径后PDCD4敲除对TFEB的影响;使用PDCD4基因敲除体系,通过免疫蛋白印迹,检测PDCD4敲除对TFEB泛素化修饰的影响。4.检测PDCD4调控TFEB翻译是否依赖于eIF4A:在PDCD4敲除或过表达的小鼠巨噬细胞和胚胎成纤维细胞中,分别干扰或过表达eIF4A,免疫蛋白印迹检测PDCD4调控TFEB是否依赖于eIF4A。5.明确PDCD4调控TFEB翻译的分子机制和结构域:使用RNA-蛋白免疫共沉淀技术检测PDCD4是否结合TFEB mRNA;使用报告酶基因技术检测PDCD4调控TFEB的三个5’UTR情况。根据PDCD4抑制蛋白质翻译的两种方式,构建PDCD4功能域截短体质粒,使用PDCD4敲除的小鼠胚胎成纤维细胞探究PDCD4调控TFEB翻译的分子机制和结构域。四.PDCD4通过TFEB调控巨噬细胞极化和抗肿瘤作用1.检测PDCD4对巨噬细胞极化的影响:体外实验使用野生型和PDCD4基因敲除小鼠巨噬细胞,分别使用LPS和IL-4诱导巨噬细胞极化,通过实时定量PCR技术、免疫蛋白印迹和流式细胞术,检测巨噬细胞M1和M2极化的相关分子marker表达情况,探究PDCD4对巨噬细胞极化的影响。2.检测PDCD4对肿瘤相关巨噬细胞的极化调控:使用肿瘤培养上清和肿瘤-巨噬细胞共培养两种体系,通过实时定量PCR技术、免疫蛋白印迹和流式细胞术,检测肿瘤微环境中PDCD4对巨噬细胞极化的影响。3.检测PDCD4调控巨噬细胞的抗肿瘤作用:使用体外肿瘤-巨噬细胞共培养体系,检测肿瘤细胞的增殖能力。使用两种体内小鼠皮下成瘤模型,检测PDCD4敲除巨噬细胞对肿瘤生长和质量的影响。结果一.PDCD4通过TFEB负向调控溶酶体功能1.PDCD4负向调控溶酶体数目:使用免疫荧光技术染色溶酶体标志性蛋白LAMP1,分别检测PDCD4敲除或过表达后小鼠巨噬细胞和胚胎成纤维细胞溶酶体形态、大小和数目。结果显示,PDCD4对溶酶体的形态和大小没有影响,但明显改变溶酶体的数目。2.PDCD4负向调控溶酶体活性:使用流式细胞术染色溶酶体特异性活性探针Lysotracker,检测PDCD4敲除或过表达对小鼠巨噬细胞和胚胎成纤维细胞中溶酶体活性的影响。结果显示,PDCD4敲除显着提高溶酶体活性,过表达PDCD4抑制溶酶体活性。3.PDCD4抑制溶酶体相关蛋白表达:使用免疫蛋白印迹技术,检测PDCD4敲除或过表达对小鼠巨噬细胞和胚胎成纤维细胞中检测溶酶体相关膜蛋白和溶酶体酶的表达情况。结果显示,PDCD4敲除显着提高溶酶体相关膜蛋白1（LAMP1）和溶酶体重要的组织蛋白酶B和D的（CTSB/CTSD）表达;过表达PDCD4则抑制溶酶体相关蛋白表达。4.PDCD4通过TFEB负向调控溶酶体:①分别在PDCD4敲除或过表达的小鼠巨噬细胞和胚胎成纤维细胞中,干扰TFEB表达,使用免疫荧光、流式细胞术和免疫蛋白印迹检测溶酶体数目、活性和相关蛋白表达情况。结果显示,干扰TFEB能够逆转由PDCD4敲除带来的溶酶体数目增加、活性提高和相关蛋白表达增加,说明PDCD4是通过TFEB调控溶酶体。②使用实时定量PCR技术检测TFEB调控的一系列下游基因的表达情况。结果显示,PDCD4负向调控TFEB下游基因的表达。在PDCD4敲除体系中,干扰TFEB可以逆转由PDCD4敲除带来的表达增加。二.PDCD4抑制TFEB入核不依赖于mTOR和ERK活性1.PDCD4抑制TFEB细胞核定位:①在PDCD4敲除的小鼠巨噬细胞和胚胎成纤维细胞中,分离细胞浆和细胞核蛋白,使用免疫蛋白印迹检测TFEB在细胞浆和细胞核中表达情况。结果显示,PDCD4抑制细胞核中TFEB表达,敲除PDCD4显着提高细胞核中TFEB的表达。②使用免疫荧光,特异性染色TFEB检测其亚细胞定位情况。结果显示,PDCD4敲除促进TFEB细胞核定位,过表达PDCD4则抑制其细胞核定位。2.PDCD4抑制TFEB细胞核定位不依赖mTORC1活性:在PDCD4敲除或过表达的小鼠巨噬细胞和胚胎成纤维细胞中,分别使用EBSS饥饿或mTORC1特异性抑制剂来抑制mTORC1活性,检测TFEB在细胞浆和细胞核中的表达情况;同时检测PDCD4表达变化过程中,mTORC1活性情况;以干扰TFEB组为对照。免疫蛋白印迹结果显示,抑制mTORC1活性不改变PDCD4对TFEB入核的负向调控作用;敲除或过表达PDCD4也不影响mTORC1活性,说明PDCD4调控TFEB细胞核定位不依赖于mTORC1活性。3.PDCD4抑制TFEB细胞核定位不依赖ERK2活性:在敲除PDCD4的小鼠巨噬细胞和胚胎成纤维细胞中,使用免疫蛋白印迹检测ERK2活性情况。结果显示,PDCD4表达变化不影响ERK2活性,说明PDCD4调控TFEB细胞核定位也不依赖于ERK2活性。三.PDCD4通过其MA-3结构域以eIF4A依赖的方式抑制TFEB翻译进而在总体水平上调控TFEB1.PDCD4不影响TFEB的mRNA表达:在多种细胞系中,敲除、干扰或梯度过表达PDCD4,使用实时定量PCR技术,检测PDCD4表达变化对TFEB mRNA表达的影响。结果显示,改变PDCD4的表达对TFEB mRNA表达没有明显影响。2.PDCD4抑制TFEB蛋白表达:在多种细胞系中,敲除、干扰或梯度过表达PDCD4,使用免疫蛋白印迹,检测PDCD4表达变化对TFEB蛋白水平的影响。结果显示,敲除或干扰PDCD4可以明显增加TFEB的蛋白表达水平,过表达PDCD4则明显抑制TFEB表达且存在梯度依赖性。3.PDCD4不影响TFEB的降解和稳定性:①使用免疫蛋白印迹,通过MG132阻断蛋白质降解途径和CHX阻断蛋白质合成途径,检测PDCD4对TFEB的影响。结果显示,PDCD4不影响TFEB的降解途径和蛋白质稳定性。②使用免疫蛋白印迹检测PDCD4敲除对TFEB泛素化修饰的影响。结果显示,PDCD4不影响TFEB的泛素化修饰情况。4.PDCD4抑制TFEB翻译依赖于eIF4A:在PDCD4敲除或过表达的小鼠巨噬细胞和胚胎成纤维细胞中,分别干扰或过表达eIF4A,免疫蛋白印迹检测PDCD4调控TFEB是否依赖于eIF4A。结果显示,在敲除PDCD4体系中干扰eIF4A能够抑制TFEB表达,在PDCD4过表达体系中同时过表达eIF4A则能够提高TFEB表达,说明PDCD4抑制TFEB翻译是eIF4A依赖的方式。5.PDCD4通过其MA-3结构域抑制TFEB翻译:①使用RNA-蛋白免疫共沉淀技术发现PDCD4可以结合TFEB mRNA。②使用报告酶基因技术发现PDCD4调控TFEB的三个5’UTR且主要作用于第二种类型的5’UTR。③根据PDCD4抑制蛋白质翻译的两种方式,构建PDCD4功能域截短体质粒,使用PDCD4敲除的小鼠胚胎成纤维细胞过表达全长和各截短体质粒。结果显示,PDCD4通过其MA-3结构域抑制TFEB翻译,并且通过检测细胞浆和细胞核中TFEB的表达情况发现PDCD4是通过抑制TFEB总体表达水平来抑制其入核。四.PDCD4通过TFEB调控巨噬细胞极化和抗肿瘤作用1.PDCD4敲除促进巨噬细胞向M1型极化:体外实验使用LPS和IL-4诱导巨噬细胞极化,通过实时定量PCR技术、免疫蛋白印迹和流式细胞术,检测巨噬细胞M1和M2极化的相关分子marker。结果显示,PDCD4敲除能够明显促进巨噬细胞向M1型极化,抑制巨噬细胞向M2型极化。2.PDCD4敲除抑制肿瘤相关巨噬细胞向M2型极化:使用肿瘤培养上清和肿瘤-巨噬细胞共培养两种体系,通过实时定量PCR技术、免疫蛋白印迹和流式细胞术,检测肿瘤微环境中PDCD4对巨噬细胞极化的影响。结果显示,PDCD4敲除能够抑制肿瘤相关巨噬细胞向M2型极化。3.PDCD4敲除提高巨噬细胞的抗肿瘤作用:①使用体外肿瘤-巨噬细胞共培养体系,检测肿瘤细胞的增殖能力。结果显示,敲除PDCD4基因的巨噬细胞能够抑制肿瘤细胞增殖,干扰TFEB则逆转其对肿瘤细胞的抑制能力。②使用两种体内小鼠皮下成瘤模型,检测PDCD4敲除巨噬细胞对肿瘤生长和质量的影响。结果显示,PDCD4敲除巨噬细胞能够明显抑制肿瘤的生长和肿瘤质量;PDCD4敲除的巨噬细胞中干扰TFEB表达,则逆转其对肿瘤生长和质量的抑制能力,降低其抗肿瘤能力。说明PDCD4敲除能够通过上调TFEB的表达,提高巨噬细胞抗肿瘤能力。结论1.PDCD4能够参与并且负向调控溶酶体发生和溶酶体功能。2.PDCD4抑制TFEB的细胞核定位不依赖于mTORC1和ERK2活性。3.PDCD4通过抑制TFEB的蛋白质翻译在总体水平上抑制其表达和细胞核定位,实现对溶酶体发生和溶酶体功能的负向调控。4.PDCD4通过其MA-3结构域以eIF4A依赖的方式抑制TFEB翻译,PDCD4能够调控TFEB的三个5’UTR但主要作用于第二种5’UTR。5.PDCD4敲除能够抑制巨噬细胞向M2型极化,并且通过提高TFEB的表达来提高巨噬细胞的抗肿瘤能力。创新性和意义1.PDCD4是重要的抑癌基因和蛋白质翻译抑制因子,我们的实验发现了PDCD4新的靶基因TFEB,证实PDCD4能够通过其MA-3结构域以eIF4A依赖的方式抑制TFEB翻译。首次发现PDCD4可以通过抑制TFEB翻译来负向调控溶酶体功能,为明确PDCD4在溶酶体发生和溶酶体功能方面的作用提供了新的理论依据。2.结合前期已经发表的关于PDCD4抑制细胞自噬的相关机制,我们的实验完整的阐述了 PDCD4在溶酶体和自噬方面的调控机制,为调控细胞的能量感知、维持细胞的代谢稳态和了解细胞的自噬溶酶体通路提供了重要的理论基础。3.TFEB是调控溶酶体的关键转录因子,目前关于TFEB的调控主要集中在其磷酸化修饰方面,我们的研究首次阐明了 TFEB在蛋白翻译水平上的调控机制,为充分了解TFEB的整个调控网络提供了重要的理论依据。为靶向溶酶体治疗溶酶体储存障碍、神经退行性疾病和肿瘤等溶酶体相关疾病提供了很好的理论支撑。4.PDCD4分子是抑癌基因,在肿瘤细胞中过表达PDCD4能够抑制肿瘤细胞的溶酶体功能进而抑制其增殖和迁移能力。然而,在肿瘤相关的免疫细胞中,需要敲除或降低PDCD4表达来提高免疫细胞溶酶体功能,增强免疫细胞的生物学功能。说明PDCD4在肿瘤细胞和肿瘤相关免疫细胞中表现出相反的作用,我们的研究为靶向PDCD4治疗肿瘤提供了非常重要理论指导。局限性1.TFEB属于MIT-TFE家族成员,我们的研究关注了 PDCD4对TFEB的调控机制和生理作用。然而,PDCD4能否参与调节MIT-TFE家族的其他成员尚不清楚,需要进一步实验研究。2.TFEB能够参与并调控非常多的溶酶体相关疾病,我们的研究主要关注TFEB在肿瘤相关巨噬细胞中的作用和意义。然而,靶向PDCD4调控TFEB在其他溶酶体相关疾病,如神经退行性疾病和代谢性疾病中的作用有待进一步实验探究。
王乾[8]（2020）在《联合抑制BRD4与HDAC3通过GLI1/IL-6/STAT3信号通路诱导脑胶质瘤凋亡的机制研究》文中指出背景:恶性胶质瘤是颅内最常见的肿瘤,呈侵袭性生长,恶性程度高。多数患者生存期仅能达到12至15个月,5年生存率低于5%[1]。作为一种高度异质性的肿瘤,恶性胶质瘤具有复杂的基因和信号的改变。现阶段对于恶性脑胶质瘤的主要治疗方法是以手术为主,辅以化疗、放疗以及靶向治疗,即便是具有针对性的分子靶向药物,临床试验治疗效果仍不理想[2],这可能与胶质瘤干细胞的存在密切相关。因此,从胶质瘤干细胞的角度探究脑胶质瘤患者生存预后差的潜在机制,为治疗脑胶质瘤、改善预后及提高生存率具有重要的意义。近年研究发现,恶性胶质瘤中存在着表观遗传学调节的异常。表观遗传学调节可以支配脑胶质瘤细胞在致瘤和非致瘤状态之间动态转变。与基因突变不同,表观遗传的改变是可逆的[3,4]。因此,寻找脑胶质瘤表观遗传学关键位点,利用表观遗传学机制进行干预,恢复脑胶质瘤细胞表观遗传学修饰的正常状态,有利于制定新的治疗策略,为脑胶质瘤的治疗和预后提供新的方向。组蛋白去乙酰化酶3（histone deacetylase 3,HDAC3）是组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase,HDAC）家族第I类成员之一,可以催化组蛋白和其他蛋白质的去乙酰化,参与多种基因的转录调控,在细胞发育和肿瘤中发挥重要的作用[5,6]。RGFP966是近年发现的HDAC3抑制剂,作用靶点为HDAC3,对其它HDAC无有效的抑制作用[7]。文献报道,HDAC3抑制剂RGFP966既可以通过诱导凋亡抑制皮肤T细胞淋巴瘤的增殖[8],也可以通过促进恶性血液肿瘤细胞分化而抑制肿瘤的增殖[9],提示HDAC3在多种肿瘤中表达异常并与肿瘤的发生发展密切相关。本课题组在前期工作中,对自转基因小鼠(h GFAP-Cre+p53L/LPtenL/+)脑胶质瘤自发模型[10]中提取的脑胶质瘤干细胞进行sh RNA表观遗传学文库筛查,发现HDAC3下调能够明显抑制小鼠脑胶质瘤干细胞（Glioma stem cell,GSC）的增殖能力。在脑胶质瘤干细胞异种移植瘤的小鼠模型中,HDAC3抑制剂RGFP966（HDAC3i）能抑制小鼠脑胶质瘤干细胞移植瘤的生长,但仍呈现一定的增长率。有文献证实,白血病抑制因子受体的激活限制了乳腺癌中组蛋白去乙酰化转移酶（HDAC）抑制剂的抗肿瘤效应,因此,推测那些不能被HDAC3i抑制的残留的脑胶质瘤干细胞可能通过某种促生长的基因的乙酰化水平维持异常的自我更新。BRD4是转录和表观遗传调控因子。研究发现,BRD4是BET（Bromodomain and extra terminal domain）家族中一种重要的转录延伸的调节子,可以募集正向转录延伸因子复合体（P-TEFb）,并引起RNA聚合酶II的激活,从而促进癌基因,如c-Myc等的表达。组蛋白的乙酰化需要先被“乙酰化阅读器蛋白”识别,然后才能产生最终的转录结果。BRD4是组蛋白乙酰化所介导的转录过程中所需的“阅读器蛋白”。它具有两个串联的溴结构域（BD1,BD2）,并通过溴结构域识别并结合组蛋白末端乙酰化的赖氨酸位点,参与表观遗传基因的读取和调控[11]。在四种乙酰化标记位点H3K14ac、H3K27ac、H3K122ac和H4K16ac中,BRD4与H3K27Ac位点的结合与非常高的基因活性密切相关。而BRD4选择性抑制剂JQ1（BRD4i）,可与BRD4蛋白的溴结构域竞争性结合,从而取代BRD4蛋白与染色质上的乙酰化赖氨酸的结合,将BRD4置换下来,在包括NUT中线癌、骨肿瘤以及血液系统肿瘤中显示出良好的抗肿瘤效果,并可以显着抑制STAT3信号通路[12,13]。同时,前期工作发现,HDAC3i能够诱导STAT3在酪氨酸705位点的磷酸化,而STAT3通路的激活又与肿瘤的生长密切相关。因此,若能抑制这种激活,有望增强HDAC3i对胶质瘤干细胞的抑制作用,从而进一步提高HDAC3i对脑胶质瘤的治疗效果。而BRD4i能够显着抑制脑胶质瘤干细胞中STAT3信号通路。综上,推测二者联合使用可能会展现出较强的抗肿瘤作用。GLI1是转录因子和Hh信号通路的终端效应因子。GLI1蛋白是Hh信号通路的重要转录因子,能够调节Hh通路的下游基因,在细胞增殖,分化,凋亡和迁移中起着重要作用[14,15]。已有文献证实,成神经母细胞瘤中BRD4的基因组足迹与GLI1占据的那部分重叠,BRD4能够直接调节Gli（Gli1和Gli2）的转录活性[16,17]。GLI1与IL-6启动子结合并调节IL-6的活性和表达来维持活化的STAT3[18]。在此基础上,本研究拟对单独应用BRD4i和HDAC3i以及BRD4i联用HDAC3i之后对脑胶质瘤干细胞增殖、凋亡以及STAT3信号通路的影响进行对比,观察BRD4i联合HDAC3i作用下脑胶质瘤干细胞的变化,进一步验证BRD4i联合HDAC3i治疗脑胶质瘤干细胞的协同效应,分析BRD4i和HDAC3i调节STAT3信号通路的方式,揭示BRD4i和HDAC3i协同抑制脑胶质瘤干细胞的作用机制,寻找脑胶质瘤的新的治疗靶点。目的:1、以GSCs为实验对象,联合BRD4,探究BRD4i联合HDAC3i对脑胶质瘤干细胞生长的影响;2、探究BRD4i联合HDAC3i对脑胶质瘤干细胞联合用药的效果及作用机制。方法:一、联合抑制BRD4与HDAC3对脑胶质瘤干细胞的影响。体外实验:实验分组:阴性对照组、BRD4i或si BRD4组、HDAC3i组、BRD4i联合HDAC3i组。CCK8检测对GSCs细胞活力的影响;细胞生长计数、克隆形成实验检测对GSCs增殖能力的影响;神经球成球实验检测GSCs自我更新的能力;流式细胞术检测GSCs细胞凋亡和细胞周期的变化;TUNEL染色检测GSCs细胞凋亡;q RT-PCR检测细胞凋亡、细胞周期相关基因以及分化标志物的表达变化;免疫荧光检测GSCs相关分化标志物的表达。体内实验:实验分组:阴性对照组、BRD4i组、HDAC3i组、BRD4i联合HDAC3i组。在给药治疗期间,每隔一天观察并测量肿瘤的长度和宽度,称量小鼠体重。给药治疗21天后,将小鼠脱颈处死,对肿瘤体积（V=1/2长×宽2）和小鼠体重进行统计分析。免疫组织化学染色观察对脑胶质瘤干细胞增殖和分化标记物的影响;TUNEL染色检测细胞凋亡;q RT-PCR检测细胞凋亡和周期相关基因以及分化标志物的表达变化;Western-blot分析STAT3以及下游基因蛋白Bcl-2、Mcl-1的表达。二、联合抑制BRD4与HDAC3抑制恶性脑胶质瘤干细胞生长的作用机制。采用不同浓度的HDAC3i溶液作用于CSC2078细胞。ELISA试剂盒验证HDAC3的活性;CCK8实验检测HDAC3i对CSC2078细胞的影响;Western-blot检测STAT3以及下游基因蛋白水平的变化。利用sh STAT3和HDAC3i作用于CSC2078细胞,Western-blot分析STAT3以及下游基因Bcl-2、Mcl-1蛋白水平的变化;细胞生长计数实验分析细胞的增殖能力;神经球成球实验检测细胞自我更新的能力。不同浓度的BRD4i溶液作用于CSC2078细胞,Western-blot实验检测STAT3、p-STAT3（Tyr705）蛋白表达水平的变化。利用RNA-seq测序分析BRD4i联合HDAC3i抑制脑胶质瘤干细胞生长过程中的关键分子;Western-blot验证对STAT3信号通路的影响;Ch IP分析HDAC3i对GLI1基因启动子处H3K27位点的乙酰化以及GLI1启动子处BRD4的募集情况;ELISA检测IL-6的分泌水平;Ch IP分析GLI1对IL-6的调控作用;Western-blot分析IL-6以及STAT3通路的变化。结果:一、联合抑制BRD4与HDAC3可以有效协同抑制脑胶质瘤干细胞生长体外实验:CCK8检测结果显示,与阴性对照组、BRD4i或si BRD4组和HDAC3i组相比,BRD4i联合HDAC3i组对GSCs细胞活力的抑制作用最为明显,且呈现出显着的协同效应;细胞生长计数结果表明,与阴性对照组、BRD4i或si BRD4组和HDAC3i组相比,BRD4i或si BRD4联合HDAC3i组GSCs数量明显减少;克隆形成实验证实,与阴性对照组、BRD4i组和HDAC3i组相比,BRD4i联合HDAC3i组GSCs所形成的克隆数量最少;神经球成球实验结果显示,与阴性对照组、BRD4i或si BRD4组和HDAC3i组相比,BRD4i或si BRD4联合HDAC3i组GSCs自我更新能力显着降低;流式细胞术结果表明,与阴性对照组、BRD4i或si BRD4组和HDAC3i组相比,BRD4i或si BRD4联合HDAC3i组GSCs发生凋亡的细胞所占的比重最多,且绝大部分细胞发生G1期的细胞阻滞;TUNEL染色结果表明,与阴性对照组、BRD4i组和HDAC3i组相比,BRD4i联合HDAC3i组GSCs出现绿色荧光的细胞数量最多,且荧光强度最强;q RT-PCR检测结果显示,与阴性对照组、BRD4i组和HDAC3i组相比,BRD4i联合HDAC3i组GSCs促凋亡基因Bim、Bax表达显着上调、抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-XL表达显着下调,周期相关基因以及分化标志物的表达也发生显着变化;免疫荧光结果显示,与阴性对照组、BRD4i组和HDAC3i组相比,BRD4i联合HDAC3i组GSCs中成熟的星型胶质细胞标志物S-100β的增强最为明显。体内实验:对肿瘤大小和小鼠体重进行统计分析,结果显示,与阴性对照组、BRD4i组和HDAC3i组相比,BRD4i联合HDAC3i组小鼠肿瘤体积最小,而四组的小鼠体重变化并不存在显着差异;免疫组织化学染色结果发现,与阴性对照组、BRD4i组和HDAC3i组相比,BRD4i联合HDAC3i组肿瘤增殖和分化的标记物变化最显着;TUNEL染色检测结果显示,与阴性对照组、BRD4i组和HDAC3i组相比,BRD4i联合HDAC3i组发生细胞凋亡比重显着增加;q RT-PCR结果显示,与阴性对照组、BRD4i组和HDAC3i组相比,BRD4i联合HDAC3i组促凋亡基因Bim、Bax表达显着上调、抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-XL表达显着下调,周期相关基因以及分化标志物的表达变化最为显着;Western-blot结果表明,与阴性对照组、BRD4i组和HDAC3i组相比,BRD4i联合HDAC3i组磷酸化的STAT3以及下游基因Bcl-2、Mcl-1的蛋白表达受到显着抑制。二、联合抑制BRD4与HDAC3通过GLI1/IL-6/STAT3信号通路诱导脑胶质瘤干细胞周期阻滞和凋亡ELISA试剂盒验证HDAC3i能显着抑制HDAC3的活性;CCK8结果显示HDAC3i对CSC2078细胞活力产生抑制作用,但即使在作用浓度为1u M（HDAC3活性显着降低）时,细胞活力仍在80%以上;Western-blot结果表明HDAC3i能诱导STAT3在705位点的磷酸化以及下游基因Bcl-2、Mcl-1蛋白水平的增加,而利用sh STAT3能显着抑制HDAC3i诱导的STAT3的激活以及Bcl-2、Mcl-1的表达;细胞生长计数实验结果显示,与阴性对照组、HDAC3i组相比,sh STAT3联合HDAC3i组的GSCs细胞数量显着减少;神经球成球实验结果证实,与阴性对照组、HDAC3i组相比,sh STAT3联合HDAC3i组GSCs神经球成球能力受到显着抑制;Western-blot实验结果显示BRD4选择性抑制JQ1（BRD4i）作用于CSC2078细胞之后能引起p-STA T3（Tyr705）蛋白表达水平的不同程度的下降。RNA-seq数据分析显示,与对照组相比,经过HDAC3i处理的GSCs与BRD4i联合HDAC3i处理的GSCs之间存在1294个重叠基因。在1294个基因中,有35个基因在受到HDAC3i诱导后表达上调,而在加入BRD4i之后,表达受到显着抑制。如图5A所示,相对转录水平=log 2（每个基因的倍数变化）。在这种情况下,根据相对转录水平（|BRD4i&HDAC3i|-|BRD4i|+HDAC3i）计算每个基因的协同指数。例如,Gm20661的相对转录水平为-3.829（BRD4i组）,2.205（HDAC3i组）和-1.167（BRD4i&HDAC3i组）,因此Gm20661的协同指数为-0.457（|-1.167|-|-3.829|+2.205）。根据此计算方法,在这35个基因中,GLI1的协同指数是最强的。因此,推测GLI1是BRD4i联合HDAC3i抑制脑胶质瘤干细胞生长过程中的关键分子;Western-blot证实联合抑制BRD4与HDAC3能显着抑制GLI1的表达,而GLI1下调能抑制STAT3信号通路,si GLI1联合HDAC3i能显着抑制STAT3信号通路以及Bcl-2和Mcl-1的表达;Ch IP-q PCR结果表明HDAC3i能增强GLI1基因启动子处H3K27位点的乙酰化水平并在GLI1基因启动子处募集更多BRD4来参与转录;q RT-PCR和Western-blot证实GLI1的下调能抑制IL-6的m RNA水平和蛋白水平,同时,ELISA结果表明si GLI1能减少IL-6的分泌;Ch IP-q PCR结果表明GLI1能与IL-6启动子结合直接调控IL-6的转录;Western-blot结果表明si IL-6能抑制STAT3通路,而这种抑制作用又同时能被外源性的IL-6恢复。结论:1、BRD4i联合HDACi协同抑制胶质瘤干细胞增殖和自我更新,诱导胶质瘤干细胞周期阻滞和凋亡,并诱导其向成熟的星型胶质细胞分化。2、HDACi能够增强GLI1基因组蛋白H3K27位点的乙酰化,激活IL-6/STAT3信号通路,限制了HDACi对于脑胶质瘤干细胞的抑制作用;联合BRD4i后,抑制了GLI1的转录,进一步抑制IL-6/STAT3通路,从而发挥协同抗肿瘤的作用。
张弛[9]（2020）在《MicroRNA-138在脑胶质瘤中的表达及其对胶质瘤恶性生物学行为影响的机制研究》文中研究指明脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发肿瘤,也是颅内肿瘤患者死亡的主要原因。其病死率在各种肿瘤中排名第3位,仅次于肺癌和胰腺癌。脑胶质瘤的发生发展是一个非常复杂的生物学过程。脑胶质瘤的发病原因目前还不清楚,可能与头部外伤、病毒感染、内分泌、代谢紊乱以及分子遗传等因素有关。除了手术、放疗及药物治疗等传统治疗手段,一些新的治疗手段,如免疫治疗、干细胞治疗、基因治疗、电场治疗等开始兴起并用于脑胶质瘤的治疗。令人遗憾的是,这些治疗手段的有效率仍然很低。因此,我们迫切需要深入地了解脑胶质瘤发生发展的分子机制,为更加有效的诊治脑胶质瘤寻找新的分子靶点。MicroRNAs（miRNAs）是一类短的单链非编码RNA,通过与靶基因3’-非翻译区（3’UTR）的互补结合抑制靶基因的翻译或使其直接降解,从而调控该靶基因的表达。据报道,超过60%的蛋白质翻译是由miRNAs调控的。miRNAs调控了与肿瘤生物学行为相关的大部分细胞过程,包括细胞增殖、凋亡、分化和转移。miRNA表达异常已经在多种人类癌症中被发现。越来越多的证据表明,miRNA是脑胶质瘤进展的新调节因子和肿瘤治疗的新靶点。特别地,miR-138在多种肿瘤中呈现低表达,并抑制肿瘤细胞的生长和转移,表明miR-138与肿瘤的发生、发展有密切关系,但其在脑胶质瘤中的作用及分子机制鲜有报道。在本研究中,我们研究了miR-138在脑胶质瘤中的潜在作用。我们首先检测了miR-138在人脑胶质瘤细胞和组织中的表达水平,并检测了其对细胞生长、凋亡和侵袭力的影响。此外,我们还探讨了miR-138在脑胶质瘤中的作用机制。我们的研究将有助于更好地了解脑胶质瘤的发病机制,为寻找新的脑胶质瘤治疗靶点提供理论依据。第一部分miR-138在脑胶质瘤组织和细胞中的表达水平目的:研究miR-138在脑胶质瘤组织和细胞系中的表达情况,分析其表达水平与脑胶质瘤患者临床病理级别之间以及预后的相关性。方法:采用实时荧光定量PCR（q RT-PCR）检测48例脑胶质瘤组织、12例正常人体脑组织及4个脑胶质瘤细胞系中miR-138的表达水平。分析miR-138水平与患者临床病理级别的相关性。结果:qRT-PCR结果显示miR-138在脑胶质瘤组织中的表达低于正常人脑组织。临床病理分析发现,miR-138的表达与病理分级相关（P=0.013）,而与病人的年龄、性别、肿瘤的大小以及肿瘤发生的位置无明显关系。Kaplan-Meier生存分析显示,miR-138高表达患者比miR-138低表达患者的生存期延长。此外,胶质瘤细胞U87和U251中miR-138表达高于A172和U133胶质瘤细胞。结论:miR-138在脑胶质瘤组织和细胞中呈低表达,且与患者的临床病理分级及生存期密切相关。这些结果表明miR-138可能在胶质瘤的发生发展中发挥着重要作用。第二部分miR-138对胶质瘤细胞增殖、凋亡和侵袭的影响目的:研究miR-138对胶质瘤细胞生物学行为的影响,为揭示miR-138作为胶质瘤新的分子治疗靶点,将来通过干预miR-138来治疗胶质瘤提供实验依据。方法:将miR-138模拟物（miR-138 mimics）及阴性对照（miR-NC）转染胶质瘤细胞系U87和U251,利用MTT法检测细胞的增殖能力,流式细胞技术检测凋亡水平,Transwell侵袭实验检测细胞的侵袭能力。结果:miR-138 mimics转染的胶质瘤细胞大幅度提高了细胞中miR-138的表达水平。MTT实验结果表明miR-138过表达能够抑制胶质瘤细胞U87和U251的增殖能力。Transwell侵袭实验结果表明miR-138过表达可以抑制胶质瘤细胞的侵袭能力。此外,流式结果表明miR-138过表达会促进胶质瘤细胞的凋亡。结论:miR-138在脑胶质瘤中是一个潜在的肿瘤抑制基因。第三部分miR-138介导CREB1调控AKT/mTOR通路影响胶质瘤细胞凋亡及侵袭目的:筛选和鉴定miR-138的靶基因,阐明miR-138在胶质瘤细胞中发挥抑癌作用的机制,为脑胶质瘤的诊断和治疗提供新的思路和方向。方法:1)利用生物信息学软件预测miR-138的潜在靶基因CREB1,并利用双荧光素酶报告基因实验验证miR-138与CREB1 3’UTR的结合。检测48例脑胶质瘤组织和12例正常人体脑组织中CREB1的表达情况,并分析在脑胶质瘤组织中miR-138和CREB1的表达相关性。过表达miR-138后采用q RT-PCR和western blotting检测靶基因CREB1 m RNA和蛋白水平的变化。2)通过si RNA沉默胶质瘤细胞系U87和U251中CREB1的表达,观察胶质瘤细胞的增殖、凋亡及侵袭的生物学行为变化。进行营救实验,即将miR-138 mimics和CREB1慢病毒（Lenti-CREB1）共转染U87和U251细胞,观察胶质瘤细胞生物学功能的变化。3)Western blotting分析AKT/m TOR信号通路的激活、抗凋亡蛋白Bcl-2和侵袭相关蛋白MMP-2的表达对miR-138及CREB1表达变化的响应。结果:1)生物信息学软件预测发现CREB1是miR-138的一个潜在靶基因。双荧光素酶报告基因实验结果显示miR-138可以与CREB1的3’UTR的直接结合。q RT-PCR和western blotting分析发现miR-138过表达能下调CREB1的基因和蛋白表达水平。在脑胶质瘤组织中CREB1的表达高于正常脑组织,CREB1和miR-138的表达在脑胶质瘤组织中呈现负相关性。2)CREB1敲低能抑制胶质瘤细胞U87和U251的增殖和侵袭,促进胶质瘤细胞的凋亡,与miR-138过表达有相似的结果。miR-138 mimics和Lenti-CREB1共转染胶质瘤细胞能逆转miR-138对胶质瘤细胞增殖和侵袭的抑制、及凋亡的促进作用。3)Western blotting分析发现,miR-138过表达能下调胶质瘤细胞中p-AKT、p-m TOR、Bcl-2及MMP-2的蛋白表达,而CREB1表达质粒能上调胶质瘤细胞中p-AKT、p-m TOR、Bcl-2及MMP-2的蛋白表达。在miR-138过表达的细胞中,CREB1的上调能够逆转miR-138对AKT/m TOR的去磷酸化以及Bcl-2和MMP-2蛋白表达的抑制。结论:miR-138通过靶向CREB1抑制AKT/m TOR信号通路的激活和Bcl-2、MMP-2的表达,从而调控胶质瘤细胞增殖、凋亡和侵袭行为。miR-138可能是治疗脑胶质瘤的潜在靶点。
梁德熀[10]（2020）在《骨化三醇对脑胶质瘤小鼠模型中髓系抑制性细胞的影响》文中研究说明髓系来源抑制细胞（Myeloid-derived suppressor cells,MDSCs）是一类未成熟,具有抑制性功能的细胞。研究发现MDSCs在肿瘤微环境中扮演重要角色。肿瘤来源的细胞因子和生长因子能够促进MDSCs扩增或者活化,MDSCs则通过多种机制产生免疫耐受环境促进肿瘤生长。MDSCs是肿瘤免疫疗法失败的主要原因之一。针对MDSCs的靶向治疗能够减少免疫抑制作用,从而增强对免疫疗法的反应。骨化三醇（Calcitriol）是维生素D3的活性形式,通过与维生素D受体（Vitamin D receptor,VDR）结合发挥生物学功能。骨化三醇除了调节钙和磷稳态之外,其还具有影响肿瘤生长和免疫系统稳态的作用。但是,骨化三醇对在胶质瘤及其微环境中MDSCs的作用仍然未知。首先,我们对C57BL/6J小鼠进行骨化三醇预处理,对照小鼠给与相同剂量的生理盐水,两周之后使用小鼠胶质瘤细胞（GL261）构建原位肿瘤模型,并记录小鼠的生存时间,计算两组荷瘤小鼠的生存率。结果发现,与对照组相比,注射骨化三醇的荷瘤小鼠生存时间明显缩短（p<0.05）,肿瘤的面积也显着增大（p<0.05）。接着,为了明确骨化三醇影响脑胶质瘤生长的作用机制,我们利用CellTiter-Blue法检测不同浓度骨化三醇对GL261细胞和正常细胞L929（小鼠成纤维细胞）的直接作用。结果显示,骨化三醇（<10μM）对GL261和L929细胞的活力并没有明显的影响,仅当浓度高于10μM对细胞有一定毒性作用。随后,我们体外进行了小鼠骨髓细胞分化实验,我们发现加入骨化三醇能够诱导骨髓细胞向单核MDSC（Monocytic-MDSC,M-MDSC）分化,导致其比例明显的升高（p<0.001）。荧光定量PCR结果表明,骨化三醇还促进了维生素D受体（VDR）和MDSC功能相关基因精氨酸酶1（ARG1）的表达。随后,在建模第18天采用流式细胞术检测脑组织、脾脏和骨髓区域MDSCs,T淋巴细胞的比例。流式数据显示,骨化三醇可以引起荷瘤小鼠脑组织区域M-MDSC比例升高（p<0.05）,而在脾脏和骨髓区域没有明显差异。脑组织、脾脏和骨髓中CD4+和CD8a+T淋巴细胞比例也没有显着差异。最后,为了进一步验证骨化三醇在脑胶质瘤中生物学意义,我们检测了其受体VDR在脑胶质瘤中的表达及其与脑胶质瘤患者预后的相关性。免疫组织化学染色和蛋白印迹检测的结果表明,肿瘤区域的VDR表达水平明显高于小鼠正常脑组织,且骨化三醇可导致VDR在肿瘤区域表达的进一步升高。TCGA数据库中152例胶质母细胞瘤患者的生存分析显示VDR表达越高,患者的生存时间越短。本研究结果表明,VDR在脑胶质瘤中高表达并与肿瘤患者的预后呈负相关,骨化三醇能够增强小鼠脑胶质瘤中VDR的表达,荷瘤小鼠肿瘤局部M-MDSC的浸润增加,促进脑胶质瘤的生长。
二、脑胶质细胞瘤患者IL-6的表达及细胞免疫功能的变化（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、脑胶质细胞瘤患者IL-6的表达及细胞免疫功能的变化（论文提纲范文）
（1）脑胶质瘤中CXCL1的表达及影响肿瘤细胞恶性行为的作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 文献综述 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 英文缩写 |
| 攻读学位期间发表的学术成果 |
（2）芳香烃受体AHR的内源性配体ITE抗神经胶质瘤的作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 1 ITE抑制神经胶质瘤的作用机制 |
| 1.1 引言 |
| 1.1.1 神经胶质瘤的研究背景 |
| 1.1.2 AHR的研究背景 |
| 1.1.3 AHR与神经胶质瘤 |
| 1.1.4 迁移相关基因VAV3 |
| 1.1.5 迁移相关基因MYH9 |
| 1.1.6 研究目的及意义 |
| 1.2 实验材料和方法 |
| 1.2.1 实验材料 |
| 1.2.2 实验方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 ITE对迁移相关基因VAV3 的作用 |
| 1.3.2 ITE对2D及3D培养细胞的影响 |
| 1.3.3 ITE对人胶质瘤细胞系U87MG迁移相关基因MYH9的影响 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 结论 |
| 2 AHR配体ITE与PD1抗体联用对神经胶质瘤免疫的影响 |
| 2.1 引言 |
| 2.1.1 GBM的免疫疗法 |
| 2.1.2 靶向特定免疫抑制因子 |
| 2.1.3 免疫检查点的介绍 |
| 2.1.4 GBM的免疫微环境 |
| 2.1.5 AHR的免疫调控 |
| 2.1.6 靶向AHR通路 |
| 2.1.7 研究目的及意义 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 ITE与PD1抗体协同作用增加原位GL261模型鼠的存活率 |
| 2.3.2 ITE与PD1抗体协同作用,增加细胞毒性免疫细胞的浸润 |
| 2.3.3 ITE与PD1协同作用对TH17/Treg比的影响 |
| 2.3.4 ITE与PD1协同作用增加CD4+CD8+T细胞的比例 |
| 2.3.5 ITE减少了原位胶质瘤模型鼠脑肿瘤组织中MDSC的浸润 |
| 2.3.6 ITE与KYN处理对GL261细胞中IL11的影响 |
| 2.3.7 ITE处理显着抑制胶质瘤细胞中STAT3的磷酸化 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 3 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（3）以免疫分子PDCD4为靶点的抗抑郁药物的设计、制备及作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 一、程序性细胞死亡因子4 |
| 二、抑郁症 |
| 三、抗抑郁药物 |
| 研究目的 |
| 材料与方法 |
| 一、材料 |
| 二、实验方法 |
| 结果 |
| 一、PDCD4特异性小干扰RNA制备、修饰及抗抑郁作用研究 |
| (一) PDCD4小干扰RNA (siPdcd4)上调神经细胞BDNF的表达 |
| (二) PDCD4小干扰RNA抑制小胶质细胞IL-6和IL-1 β的表达 |
| (三) RVG-9dR多肽携带siRNA特异性进入神经细胞 |
| (四) RVG/siPdcd4特异性沉默神经细胞PDCD4上调BDNF的表达 |
| (五) RVG/siPdcd4逆转神经细胞mTORC1失活对BDNF的抑制作用. |
| (六) RVG/siPdcd4抑制小胶质细胞IL-6和1L-1 β的表达 |
| (七) RVG-9dR携带siPdcd4跨过血脑屏障靶向入脑 |
| (八) RVG/siPdcd4靶向沉默海马和前额叶皮质PDCD4的表达 |
| (九) RVG/siPdcd4逆转CRS对海马和前额叶皮质BDNF的抑制作用. |
| (十) RVG/siPdcd4抑制CRS诱导的IL-6和IL-1β的表达 |
| (十一) RVG/siPdcd4通过修复神经突触可塑性缓解CRS诱导的抑郁样行为 |
| 二、PDCD4干扰多肽的筛选、制备及抗抑郁作用研究 |
| (一) PDCD4结合eIF4A关键序列的筛选与设计 |
| (二) eIF4A-VI通过干扰PDCD4与eIF4A结合上调BDNF的表达 |
| (三) 9R-eIF4A-VI干扰多肽靶向结合PDCD4 |
| (四) 干扰多肽特异性干扰PDCD4与eIF4A的结合 |
| (五) 干扰多肽逆转PDCD4过表达对BDNF的抑制作用 |
| (六) 干扰多肽显着上调神经细胞BDNF的表达 |
| (七) 干扰多肽逆转神经元mTORC1失活对BDNF的抑制作用 |
| (八) 海马区注射干扰多肽显着逆转CRS对BDNF的抑制作用 |
| (九) 干扰多肽通过修复神经突触可塑性缓解CRS诱导的抑郁样行为 |
| 三、PDCD4配体小分子的筛选及抗抑郁作用研究 |
| (一) PDCD4配体小分子的筛选 |
| (二) PDCD4配体小分子上调神经细胞BDNF的表达 |
| (三) PDCD4配体小分子逆转PDCD4过表达对BDNF的抑制作用 |
| (四) PDCD4配体小分子逆转神经细胞mTORC1失活对BDNF的抑制作用 |
| (五) 腹腔注射小分子ZHJ-204显着上调抑郁小鼠BDNF的表达 |
| (六) 腹腔注射小分子ZHJ-204缓解CRS诱导的抑郁样行为 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间主要科研成果及获得荣誉 |
| 附件一 英文文章1 |
| 附件二 英文文章2 |
| 附件三 综述 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 免疫印迹原始结果 |
（4）整合生物信息学分析发现免疫相关基因C5AR1可能是胶质瘤潜在的预后标志物（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 英汉缩略词对照表 |
| 胶质瘤预后标志物的研究进展(综述) |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（5）胶质母细胞瘤诊断预后标记物筛选及其验证的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 中枢神经系统肿瘤的流行病学现状 |
| 1.1.2 胶质母细胞瘤的流行病学、诊断及治疗现状 |
| 1.1.3 胶质母细胞瘤基因标记物研究现状 |
| 1.1.4 胶质母细胞瘤基因标记物研究意义 |
| 1.2 研究目的 |
| 1.2.1 了解胶质母细胞瘤基因标记物研究现状及标记物表达 |
| 1.2.2 筛选胶质母细胞瘤诊断、预后标记物 |
| 1.2.3 验证胶质母细胞瘤诊断、预后标记物 |
| 1.3 研究内容 |
| 1.3.1 胶质母细胞瘤基因标记物研究现状分析 |
| 1.3.2 胶质母细胞瘤诊断、预后标记物的筛选 |
| 1.3.3 胶质母细胞瘤诊断、预后标记物的实验验证 |
| 1.4 研究方法 |
| 1.4.1 文献计量学 |
| 1.4.2 生物信息学 |
| 1.4.3 分子生物学技术及主要统计方法 |
| 1.5 研究技术路线图 |
| 参考文献 |
| 第二章 胶质母细胞瘤基因标记物文献可视化分析 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.1.1 胶质母细胞瘤基因标记物文献可视化分析的必要性 |
| 2.1.2 胶质母细胞瘤基因标记物文献可视化分析技术路线图 |
| 2.2 数据和方法 |
| 2.2.1 数据来源与检索策略 |
| 2.2.2 纳入排除标准及文献筛选 |
| 2.2.3 数据处理及分析方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 文献检索及筛选结果 |
| 2.3.2 时间分布 |
| 2.3.3 国家和地区分布 |
| 2.3.4 机构分布 |
| 2.3.5 期刊分布 |
| 2.3.6 作者分析 |
| 2.3.7 关键词分析 |
| 2.3.8 基因标记物表达分析 |
| 2.3.9 基因标记物生物学功能及通路分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 参考文献 |
| 第三章 胶质母细胞瘤基因标记物筛选的生物信息学分析 |
| 3.1 研究背景 |
| 3.1.1 生物信息学简介 |
| 3.1.2 生物信息学在胶质母细胞瘤基因标记物研究的进展 |
| 3.1.3 生物信息学方法筛选胶质母细胞瘤基因标记物技术路线图 |
| 3.2 数据和方法 |
| 3.2.1 数据来源 |
| 3.2.2 差异表达基因分析 |
| 3.2.3 预后基因筛选 |
| 3.2.4 预后指数模型的构建 |
| 3.2.5 PI及临床混杂因素分析 |
| 3.2.6 生存分析和模型检验 |
| 3.2.7 GO基因富集分析 |
| 3.2.8 筛选基因在CGGA数据集中的验证 |
| 3.2.9 统计分析方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 TCGA胶质母细胞瘤患者肿瘤组织与GTEx数据集中正常脑组织差异表达基因分析 |
| 3.3.2 预后相关基因分析 |
| 3.3.3 PI构建 |
| 3.3.4 临床因素及其与PI的协同作用 |
| 3.3.5 生存分析和模型检验 |
| 3.3.6 GO富集分析结果 |
| 3.3.7 筛选基因在CGGA数据集的验证 |
| 3.3.8 CGGA数据集对模型预后预测能力的验证 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 参考文献 |
| 第四章 胶质母细胞瘤诊断、预后标记物的实验验证 |
| 4.1 研究背景 |
| 4.1.1 前言 |
| 4.1.2 胶质母细胞瘤诊断、预后标记物验证实验技术路线图 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验试剂耗材和实验仪器 |
| 4.2.2 研究对象 |
| 4.2.3 实时荧光定量PCR组织检测 |
| 4.2.4 Western Blot组织检测 |
| 4.2.5 免疫组织化学检测 |
| 4.2.6 细胞培养及传代 |
| 4.2.7 FN1、HSPA5 沉默载体的构建 |
| 4.2.8 qRT PCR与 Western blot实验对沉默效果的验证 |
| 4.2.9 MTT检测 |
| 4.2.10 流式细胞术凋亡检测 |
| 4.2.11 Transwell小室迁移实验 |
| 4.2.12 实时荧光定量PCR细胞检测 |
| 4.2.13 Western blot细胞检测 |
| 4.2.14 临床随访 |
| 4.2.15 统计分析与处理 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 组织实验结果 |
| 4.3.1.1 患者基线数据 |
| 4.3.1.2 FN1、GRN、HSPA5、TTYH3、TAGLN2 基因mRNA在各级别胶质瘤中表达 |
| 4.3.1.3 FN1、GRN、HSPA5、TTYH3、TAGLN2 蛋白在各级别胶质瘤表达的western blot结果 |
| 4.3.1.4 FN1、GRN、HSPA5、TTYH3、TAGLN2 蛋白在各级别胶质瘤表达的免疫组化结果 |
| 4.3.2 细胞实验结果 |
| 4.3.2.1 FN1、HSPA5基因在细胞中沉默效果的验证 |
| 4.3.2.2 FN1、HSPA5 基因沉默对细胞增殖的影响 |
| 4.3.2.3 FN1、HSPA5 基因沉默对细胞凋亡的影响 |
| 4.3.2.4 FN1、HSPA5 基因沉默对细胞迁移的影响 |
| 4.3.2.5 FN1、HSPA5 基因沉默对细胞Bax、Bcl-2、E-cadhrin、MMP9 mRNA表达的影响 |
| 4.3.2.6 FN1、HSPA5基因沉默对细胞Bax、Bcl-2、E-cadhrin、MMP9蛋白表达的影响 |
| 4.3.3 临床随访结果 |
| 4.3.3.1 随访对象基本信息及基因表达情况分析 |
| 4.3.3.2 影响患者PFS的单变量、多变量Cox回归分析与生存曲线 |
| 4.3.3.3 影响患者OS的单变量、多变量Cox回归分析与生存曲线 |
| 4.3.3.4 基因差异表达与临床病理参数之间的相关性 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 结论 |
| 参考文献 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 研究结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 研究展望 |
| 附录 |
| 缩略语表 |
| 在学期间的研究成果 |
| 一、发表论文 |
| 二、参与项目 |
| 致谢 |
（6）基于TMT蛋白质组学的差异蛋白PP1γ在胶质瘤中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 胶质瘤差异表达蛋白的筛选和初步验证 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 仪器与试剂 |
| 1.3 研究方法 |
| 1.4 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 差异蛋白PP1γ与胶质瘤临床病理特征及预后的关系 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 仪器与试剂 |
| 1.3 研究方法 |
| 1.4 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 PP1γ对胶质瘤细胞生物学行为的影响及机制研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 仪器与试剂 |
| 1.3 研究方法 |
| 1.4 数据统计 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 蛋白磷酸酶 1 与恶性肿瘤关系的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的学术成果 |
| 个人简介 |
| 新疆医科大学博士研究生学位论文 导师评阅表 |
（7）PDCD4通过eIF4A依赖的方式抑制TFEB翻译并负向调控溶酶体功能和巨噬细胞抗肿瘤能力（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 一、溶酶体是维持细胞稳态和介导信号传递的关键细胞器 |
| 二、调控溶酶体发生和功能的关键转录因子TFEB |
| 三、TFEB活性调节 |
| 四、PDCD4的结构和表达特点 |
| 五、PDCD4抑制蛋白质翻译和调控靶基因的机制 |
| 六、PDCD4在疾病中的作用 |
| 七、巨噬细胞及其在肿瘤中的作用 |
| 研究目的 |
| 材料和方法 |
| 一、动物和细胞系 |
| 二、实验仪器 |
| 三、主要实验方法 |
| 结果 |
| 一、PDCD4通过抑制TFEB调控溶酶体的发生和功能 |
| 二、PDCD4抑制TFEB细胞核定位 |
| 三、PDCD4调控TFEB细胞核定位不依赖于mTOR和ERK活性 |
| 四、PDCD4抑制TFEB的蛋白质翻译 |
| 五、PDCD4以eIF4A依赖的方式抑制TFEB翻译 |
| 六、PDCD4通过其MA-3结构域抑制TFEB翻译 |
| 七、PDCD4敲除促进巨噬细胞向M1型极化并抑制其M2极化 |
| 八、PDCD4基因敲除巨噬细胞通过增加TFEB表达进而提高巨噬细胞抗肿瘤能力 |
| 讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间主要科研成果及获得荣誉 |
| 附件一 科研论文 |
| 附件二 论文相关综述 |
| Western Blot原始数据 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（8）联合抑制BRD4与HDAC3通过GLI1/IL-6/STAT3信号通路诱导脑胶质瘤凋亡的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩写词表 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 胶质母细胞瘤概述 |
| 1.1.1 胶质瘤的分级 |
| 1.1.2 脑胶质瘤的治疗现状 |
| 1.1.3 胶质瘤干细胞 |
| 1.1.4 脑胶质瘤与表观遗传学 |
| 1.2 HDAC3 |
| 1.2.1 HDAC的分类 |
| 1.2.2 HDAC3与肿瘤 |
| 1.2.3 HDAC3与炎症 |
| 1.2.4 HDAC3抑制剂 |
| 1.3 BRD4 |
| 1.3.1 BET家族 |
| 1.3.2 BRD4与GBM |
| 1.3.3 BRD4抑制剂与肿瘤 |
| 1.3.4 BRD4抑制剂与炎症 |
| 1.3.5 BRD4抑制剂与其他疾病 |
| 1.4 GLI1 |
| 1.4.1 GLI1与HH通路 |
| 1.5 IL6/STAT3 |
| 1.5.1 IL6/STAT3 通路 |
| 1.5.2 IL6/STAT3与GBM |
| 1.5.3 GLI1与IL6/STAT3 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞 |
| 2.1.2 质粒及菌株 |
| 2.1.3 实验动物 |
| 2.2 实验试剂 |
| 2.2.1 细胞培养相关试剂 |
| 2.2.2 转染试剂及试剂盒 |
| 2.2.3 qRT-PCR相关试剂 |
| 2.2.4 Western blot的相关试剂 |
| 2.2.5 ChIP相关试剂 |
| 2.2.6 其他相关试剂 |
| 2.3 实验仪器 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 细胞培养与冻存 |
| 2.4.2 ELISA检测HDAC3 活性 |
| 2.4.3 CCK8检测细胞活力 |
| 2.4.4 Western blot检测细胞蛋白的表达情况 |
| 2.4.5 细胞生长计数法检测细胞增殖能力 |
| 2.4.6 神经球成球能力实验检测干细胞自我更新能力 |
| 2.4.7 软琼脂克隆实验检测细胞增殖能力 |
| 2.4.8 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 2.4.9 流式细胞术检测细胞周期 |
| 2.4.10 qRT-PCR检测mRNA的表达水平 |
| 2.4.11 转录组测序 |
| 2.4.12 免疫荧光 |
| 2.4.13 染色质免疫共沉淀 |
| 2.4.14 动物实验 |
| 2.4.14.1 脑胶质瘤干细胞异种移植瘤小鼠模型的建立 |
| 2.4.14.2 动物实验分组及操作 |
| 2.4.15 HE染色 |
| 2.4.16 免疫组织化学染色 |
| 2.5 统计分析 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 联合抑制BRD4和HDAC3 协同抑制脑胶质瘤干细胞生长 |
| 3.1.1 表观遗传学筛查文库 |
| 3.1.2 ELISA试剂盒证实HDAC3 抑制剂能显着抑制HDAC3 的活性 |
| 3.1.3 联合抑制BRD4与HDAC3对GSCS细胞活力的影响 |
| 3.1.4 细胞生长计数观察GSCS的增殖能力 |
| 3.1.5 软琼脂克隆形成实验观察胶质瘤干细胞的增殖能力 |
| 3.1.6 神经球成球实验检测胶质瘤干细胞的自我更新能力 |
| 3.1.7 流式细胞数检测脑胶质瘤干细胞周期的变化 |
| 3.1.8 流式细胞数检测脑胶质瘤干细胞凋亡的变化 |
| 3.1.9 TUNEL检测GSCS细胞凋亡的情况 |
| 3.1.10 qRT-PCR检测GSCS凋亡和周期相关基因的变化 |
| 3.2 联合抑制BRD4与HDAC3对TS543 细胞脑胶质瘤干细胞移植瘤的影响 |
| 3.2.1 联合抑制BRD4与HDAC3 可抑制小鼠脑胶质瘤干细胞移植瘤的生长 |
| 3.2.2 联合抑制BRD4与HDAC3 对脑胶质瘤干细胞小鼠模型凋亡的影响 |
| 3.2.3 qRT-PCR检测脑胶质瘤干细胞小鼠模型凋亡和周期相关基因的变化 |
| 3.3 联合抑制BRD4与HDAC3对GSCS分化的影响 |
| 3.3.1 qRT-PCR检测分化相关基因的变化 |
| 3.3.2 免疫荧光检测相关分化标记物的变化 |
| 3.3.3 免疫组织化学染色检测相关分化标记物的变化 |
| 3.4 联合抑制BRD4与HDAC3 通过GLI1/IL-6/STAT3 信号通路协同抑制脑胶质瘤干细胞生长 |
| 3.4.1 CCK8 检测HDAC3 抑制剂对脑胶质瘤干细胞活力的影响 |
| 3.4.2 Western-blot检测STAT3 以及下游基因蛋白水平的变化 |
| 3.4.3 细胞生长计数检测shSTAT3对CSC2078 细胞增殖的影响 |
| 3.4.4 shSTAT3对CSC2078 细胞自我更新能力的影响 |
| 3.4.5 BRD4i对 CSC2078 细胞STAT3 信号通路以及下游基因的蛋白水平的变化 |
| 3.4.6 Western-blot和免疫组织化学染色检测脑胶质瘤干细胞小鼠模型中STAT3以及下游基因蛋白水平的变化 |
| 3.4.7 RNA-seq及数据分析 |
| 3.4.8 Western-blot检测蛋白表达水平 |
| 3.4.9 GLI1对脑胶质瘤干细胞的影响 |
| 3.4.10 染色质免疫共沉淀检测GLI1 启动子的乙酰化以及BRD4与GLI1启动子的结合情况 |
| 3.4.11 IL-6对STAT3 信号通路的影响 |
| 3.4.12 联合抑制BRD4与HDAC3 诱导周期阻滞和凋亡的模型 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在读期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（9）MicroRNA-138在脑胶质瘤中的表达及其对胶质瘤恶性生物学行为影响的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略语索引 |
| 前言 |
| 第一部分 miR-138在脑胶质瘤组织和细胞中的表达水平 |
| 一、实验材料与实验方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 第二部分 miR-138对胶质瘤细胞增殖、凋亡和侵袭的影响 |
| 一、实验材料与实验方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 第三部分 miR-138介导CREB1调控AKT/mROT通路影响胶质瘤细胞凋亡及侵袭 |
| 一、实验材料与实验方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 基于microRNA的脑胶质瘤诊治进展 |
| 参考文献 |
| 博士期间发表的论文和参加科研的情况 |
| 致谢 |
（10）骨化三醇对脑胶质瘤小鼠模型中髓系抑制性细胞的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号、变量、缩略词等本论文专用术语的注释表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 髓系抑制细胞的研究现状 |
| 1.1.1 髓系抑制细胞的起源和子类型 |
| 1.1.2 MDSCs的免疫抑制活性 |
| 1.1.3 MDSCs的肿瘤血管生成和肿瘤前侵袭/转移活性 |
| 1.1.4 MDSCs扩增和激活的两个信号模型 |
| 1.1.5 MDSCs的治疗靶向 |
| 1.2 骨化三醇的研究概况 |
| 1.2.1 骨化三醇的来源 |
| 1.2.2 骨化三醇与癌症 |
| 1.2.3 骨化三醇与免疫细胞 |
| 1.3 胶质细胞瘤的研究现状 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞系 |
| 2.1.2 C57BL/6J小鼠 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 主要药品试剂及耗材 |
| 2.1.5 主要试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 细胞复苏 |
| 2.2.3 细胞传代 |
| 2.2.4 细胞冻存 |
| 2.2.5 细胞计数 |
| 2.2.6 Cell Titer-Blue检测细胞活力 |
| 2.2.7 细胞划痕实验 |
| 2.2.8 提取小鼠骨髓细胞 |
| 2.2.9 体外诱导MDSCs分化 |
| 2.2.10 小鼠胶质瘤模型的建立 |
| 2.2.11 制备GL261单个细胞 |
| 2.2.12 小鼠心脏灌输和取脑组织 |
| 2.2.13 HE染色 |
| 2.2.14 提取脾脏细胞 |
| 2.2.15 细胞RNA提取 |
| 2.2.16 RNA逆转录 |
| 2.2.17 Real-Time PCR |
| 2.2.18 流式细胞术检测MDSCs |
| 2.2.19 流式细胞术检测CD4~+和CD8a~+ |
| 2.2.20 Western blot |
| 2.2.21 免疫组织化学染色和定量 |
| 2.2.22 统计分析 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 GL261小鼠肿瘤模型的建立及分析 |
| 3.1.1 GL261胶质瘤模型的生存分析 |
| 3.1.2 GL261肿瘤模型脑组织和脾脏分析 |
| 3.1.3 荷瘤小鼠脑组织的HE染色及分析 |
| 3.2 骨化三醇对小鼠GL261和L929细胞活力的影响 |
| 3.3 骨化三醇对GL261细胞迁移的影响 |
| 3.4 骨髓细胞分化实验 |
| 3.4.1 流式细胞术检测体外培养的骨髓细胞 |
| 3.4.2 荧光定量PCR检测VDR及 MDSCs功能相关基因的相对表达 |
| 3.5 流式细胞术检测脑组织中的MDSCs、CD4~+和 CD8a~+表达情况 |
| 3.5.1 脑组织MDSCs的表达情况 |
| 3.5.2 脑组织CD4~+和CD8a~+表达情况 |
| 3.6 流式细胞术检测脾脏MDSCS,CD4~+和CD8a~+的表达情况 |
| 3.6.1 脾脏区域MDSCs表达情况 |
| 3.6.2 流式细胞术检测脾脏CD4~+和CD8a~+的表达情况 |
| 3.7 流式细胞术检测骨髓区域MDSCS,CD4~+和CD8a~+的表达情况 |
| 3.7.1 骨髓区域MDSCs表达情况 |
| 3.7.2 流式细胞术检测骨髓区域CD4~+和CD8a~+的表达情况 |
| 3.8 肿瘤区域维生素D3受体(VDR)表达分析 |
| 3.8.1 免疫组织化学检测脑组织中VDR的表达 |
| 3.8.2 Western Blot检测脑组织VDR的表达 |
| 3.8.3 VDR表达与GBM患者生存关系 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
四、脑胶质细胞瘤患者IL-6的表达及细胞免疫功能的变化（论文参考文献）
- [1]脑胶质瘤中CXCL1的表达及影响肿瘤细胞恶性行为的作用机制研究[D]. 赵津璋. 佳木斯大学, 2021(12)
- [2]芳香烃受体AHR的内源性配体ITE抗神经胶质瘤的作用机制研究[D]. 赵丽娇. 内蒙古农业大学, 2021(01)
- [3]以免疫分子PDCD4为靶点的抗抑郁药物的设计、制备及作用研究[D]. 贾玉峰. 山东大学, 2021(11)
- [4]整合生物信息学分析发现免疫相关基因C5AR1可能是胶质瘤潜在的预后标志物[D]. 罗小彬. 西南医科大学, 2021(01)
- [5]胶质母细胞瘤诊断预后标记物筛选及其验证的实验研究[D]. 刘婕婷. 兰州大学, 2021(09)
- [6]基于TMT蛋白质组学的差异蛋白PP1γ在胶质瘤中的作用及机制研究[D]. 薛晶. 新疆医科大学, 2021(08)
- [7]PDCD4通过eIF4A依赖的方式抑制TFEB翻译并负向调控溶酶体功能和巨噬细胞抗肿瘤能力[D]. 陈晓彤. 山东大学, 2021(11)
- [8]联合抑制BRD4与HDAC3通过GLI1/IL-6/STAT3信号通路诱导脑胶质瘤凋亡的机制研究[D]. 王乾. 吉林大学, 2020
- [9]MicroRNA-138在脑胶质瘤中的表达及其对胶质瘤恶性生物学行为影响的机制研究[D]. 张弛. 中国人民解放军海军军医大学, 2020(05)
- [10]骨化三醇对脑胶质瘤小鼠模型中髓系抑制性细胞的影响[D]. 梁德熀. 长春理工大学, 2020(01)