产碱杆菌CzcD基因的克隆，表达以及功能的初步研究

论文摘要

CzcD基因位于产碱杆菌（Alcaligenes eutrophus）CH34的质粒pMLO30上,研究表明:该基因编码的蛋白质是Alcaligenes eutrophus CH34中czc离子泵出系统中的一员,该系统主要通过CzcA,B,C成员完成对重金属的泵出、转运等过程,从而增强菌株对某些重金属的抗性。而CzcD对CzcA,B,C的表达有诱导作用。本论文以产碱杆菌菌株CH34的质粒为模板,经PCR扩增得到CzcD基因;并转化大肠杆菌BL21菌株,研究其诱导表达情况。同时,为了检测蛋白质CzcD是否具有一定的重金属抗性,通过设计相应的阴阳性对照,将各种菌株在不同浓度的重金属培养基中培养,检测OD600值以观察各细菌的生长状况,发现在CzcD蛋白质的作用下,转入CzcD基因的工程菌较野生型菌株的生长量大,具有相对较强的重金属抗性。本文为研究细菌对重金属的抗性机理,以及构建具有重金属抗性的工程菌来高效净化环境中重金属的污染提供一定的理论基础。本论文研究得到以下结果:1.PCR扩增得到了CzcD基因,将其转化大肠杆菌BL21菌株,得到PETCZCD菌株。当该菌液的OD600值达到1.0,培养温度为37℃时,在终浓度为1.0 mM的IPTG诱导下,蛋白有较高的表达量。2.得到不同类型的阴,阳性对照菌株:对产碱杆菌CH34的野生菌做质粒消除实验得到菌株ΔCH34。PETCZCD菌株提取质粒转化到ΔCH34中得到菌株JH。pET-28（a）空载体转化大肠杆菌BL21得到菌株PETBL21。3.CzcD蛋白质能赋予宿主菌一定的重金属钴,锌,镉的抗性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 重金属的来源
• 1.2 重金属的危害
• 1.3 重金属污染的防治
• 1.4 Alcaligenes eutrophus CH34的简介以及对重金属抗性的研究
• 1.5 微生物重金属抗性的应用与展望
• 1.6 基因克隆的方法
• 1.7 蛋白质在大肠杆菌中的异源表达
• 1.8 基因功能研究方法
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 3 结果
• 3.1 Alcaligenes eutrophus CH34的培养
• 3.2 Alcaligenes eutrophus CH34的质粒消除情况
• 3.3 CzcD基因的PCR扩增
• 3.4 原核表达载体的构建以及检测
• 3.5 原核表达载体转化E.coil BL21以及△CH34
• 3.6 CzcD基因的诱导表达
• 3.7 阳性重组子转化不同菌株后对重金属抗性的检测
• 3.8 各细菌在不同浓度的重金属中生长差异性的统计分析
• 4 讨论
• 4.1 Alcaligenes eutrophus CH34的培养
• 4.2 Alcaligenes eutrophus CH34的质粒消除
• 4.3 原核表达载体pET-CzcD的构建
• 4.4 原核表达载体pET-CzcD转化E.coil BL21以及△CH34
• 4.5 CzcD蛋白质诱导表达情况
• 4.6 CzcD蛋白质对重金属抗性的检测
• 5 小结
• 参考文献
• 在学期间研究成果
• 致谢
• 缩略词表Abbreviation
• 附录