人脂肪来源干细胞的分离、培养及生物学特性的实验研究

论文摘要

本实验以人脂肪来源干细胞（human adipose-derived stem cells, hASCs）为研究对象,体外分离、培养、扩增及鉴定,并向成脂、成骨、成软骨诱导分化,对其体外自我更新能力和多向分化潜能进行评价,为组织工程和临床软组织器官重建提供种子细胞。本研究采用胶原酶消化法和贴壁筛选法相结合从人手术切除的脂肪组织中提取脂肪来源干细胞（adipose-derived stem cells, ASCs）,倒置显微镜下观察细胞形态,MTS法绘制生长曲线,进行冻存复苏实验,利用流式细胞术检测细胞表面标志,对提取培养的细胞进行鉴定。体外诱导hASCs向成脂、成骨及成软骨分化。结果成功从人脂肪组织中分离、提取了hASCs并在体外扩增。hASCs呈成纤维细胞样生长,生长曲线显示细胞增殖需经历生长滞缓期、对数增殖期和生长平台期,其增生分裂能力很活跃。hASCs在冻存复苏后,存活率较高,而且其增殖能力和多向分化能力未见明显改变。流式细胞仪检测hASCs表面标志,表达CD29,CD44,CD73,CD90,CD105和CD166,不表达CD31,CD34,CD45和HLA-DR,符合hASCs表面标志的特点。成脂诱导14d后,细胞体积增大,胞浆内充满圆形脂滴,呈葡萄串状,有的脂滴互相融合呈现大的脂滴。油红O染色显示为亮红色的颗粒,证明其确为脂肪滴。成骨诱导28d后,经Alizarin Red S（硫酸茜红素S）染色可见:细胞呈复层生长,细胞外富集细胞外基质,基质经染色呈现橘红色,数量多,成结节状或片状存在,说明确有钙盐沉积,并出现钙盐结节。成软骨诱导42d后,经Alcian Blue/ Sirius Red（阿辛兰/天狼猩红）染色后hASCs出现重新排列,细胞排列规则,中央区似透明软骨样结构,出现丰富的蓝染软骨基质,细胞球中间出现似软骨陷窝状结构,陷窝中央似软骨细胞,而周围则为染成红色的胶原成分。综上所述,成功了建立了一种简单有效的体外分离和培养hASCs的方法。获得的hASCs生长增殖旺盛、保存方便,具有多向分化能力。hASCs可以作为细胞移植治疗和组织工程理想的种子细胞。

论文目录

• 提要
• 中文摘要
• Abstract
• 英文缩略表
• 第1章 引言
• 第2章 文献综述
• 2.1 干细胞概述
• 2.2 成体干细胞
• 2.3 脂肪来源干细胞
• 2.3.1 脂肪来源干细胞的发现
• 2.3.2 脂肪来源干细胞的命名
• 2.3.3 脂肪来源干细胞的应用
• 2.3.4 脂肪来源干细胞的未来
• 第3章 材料与方法
• 3.1 标本来源
• 3.2 实验材料
• 3.2.1 主要仪器及设备
• 3.2.2 主要试剂
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 人脂肪来源干细胞的分离、纯化和培养
• 3.3.2 人脂肪来源干细胞的生物学特性研究
• 3.3.3 人脂肪来源干细胞--多向分化能力检测
• 3.4 统计学分析
• 第4章 实验结果
• 4.1 人脂肪来源干细胞细胞形态学观察
• 4.1.1 原代培养hASCs 细胞的形态
• 4.1.2 传代hASCs 细胞的形态:
• 4.2 绘制人脂肪来源干细胞生长曲线
• 4.3 人脂肪来源干细胞的冻存及复苏
• 4.4 流式细胞术检测人脂肪来源干细胞表面标志
• 4.5 人脂肪来源干细胞诱导分化为脂肪细胞
• 4.6 人脂肪来源干细胞成骨诱导分化
• 4.7 人脂肪来源干细胞软骨诱导分化
• 第5章 讨论
• 第6章 结论
• 参考文献
• 作者简介及在学期间所取得的科研成果
• 致谢