几种奶牛乳房炎相关基因在白细胞内的表达及克隆表达

论文摘要

奶牛乳房炎是严重危害奶牛业的一种常见的复杂多发性疾病,目前尚无十分有效的治疗方法。近年来,随着分子生物学的发展,对乳房炎的研究逐渐深入到分子水平,对乳房炎相关基因的研究也取得了新的进展。本研究以中国荷斯坦奶牛白细胞为材料,提取总RNA,并利用半定量RT-PCR技术,检测了乳房炎奶牛和正常奶牛白细胞中β-防御素5、巨噬细胞炎症蛋白-3、L-选择素、S100A9和S100A12基因的mRNA表达水平。另外,还克隆了MIP-3基因和β-防御素5基因,并对其同源性进行了分析。然后以重组克隆载体质粒为模板,扩增β-防御素5基因成熟肽片段。扩增产物经EcoR I和Not I双酶切后,导入pET28a原核表达载体,并转化大肠杆菌BL21（DE3）,然后对重组菌进行诱导表达,表达产物用Tricine-SDS-PAGE进行检测。结果表明,患乳房炎奶牛白细胞中β-防御素5、MIP-3、S100A9和S100A12四种基因mRNA表达量明显上调,而L-选择素基因mRNA表达量变化不明显。经PCR鉴定、酶切鉴定和测序说明所克隆的两种基因是正确的。克隆的MIP-3基因与GeneBank上所登录的序列完全一致。人、黑猩猩和恒河猴MIP-3基因的同源性较高,犬次之,而牛与以上四者的同源性均较低。克隆的β-防御素5基因与GeneBank上登录的BNBD 5序列同源性为82%,8个位点的氨基酸存在变异,分别为第9位（P→L）、第10位（Q→V）、第14位（W→I）、第16位（M→R）、第18位（V→F）、第28位（M→T）、第35位（F→L）和第40位（P→K）。不同品种鸡的β-防御素5基因同源性较高,而牛的β-防御素5基因与鸡的同源性最低,人和鼠次之;β-防御素1、β-防御素4、β-防御素7、β-防御素8、β-防御素10、舌抗菌肽和气管抗菌肽同源性较高,β-防御素122、β-防御素122a和β-防御素123同源性较高,β-防御素119和β-防御素120同源性也较高,β-防御素5基因与其它防御素的同源性均较低。Tricine-SDS-PAGE分析结果证明,重组菌能够正确表达出目的蛋白质,而且在IPTG浓度为0.5mM、37℃诱导时表达量最大,主要以可溶性蛋白存在,相对分子质量约为6.4kDa。

论文目录

• 摘要
• Summary
• 缩略词（Abbreviations）
• 第一章 文献综述
• 1 L-选择素（L-selectin）基因
• 2 β-防御素5 （β-Defensi115）基因
• 3 巨噬细胞炎症蛋白-3（Macrophage inflammatory protein 3, MIP-3）基因
• 4 S100A9 和S100A12 基因
• 第二章 几种奶牛乳房炎相关基因在白细胞中的表达
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 3 结果
• 3.1 RT-PCR 结果
• 3.2 测序结果
• 4 讨论
• 第三章 奶牛MIP-3 基因的克隆
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 3 结果
• 3.1 MIP-3 基因PCR 扩增结果
• 3.2 重组质粒的PCR 鉴定结果
• 3.3 重组质粒的酶切鉴定结果
• 3.4 重组质粒的测序结果
• 3.5 序列分析结果
• 4 讨论
• 第四章 奶牛β-防御素5 基因的克隆与原核表达
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 3 结果
• 3.1 总RNA 提取结果
• 3.2 RT-PCR 扩增目的片段结果
• 3.3 重组克隆质粒的PCR 扩增和酶切鉴定结果
• 3.4 重组克隆质粒的测序与分析结果
• 3.5 序列比对结果
• 3.6 重组表达质粒的鉴定结果
• 3.7 重组蛋白的诱导表达结果
• 4 讨论
• 结论
• 致谢
• 参考文献
• 作者简介
• 导师简介