旋毛虫早期识别性单克隆抗体的制备及鉴定

论文摘要

旋毛虫病是由旋毛虫(Trichinella spiralis)引起的一种呈全球性分布的人兽共患寄生虫病,可感染人及150多种动物,在我国该病仍有发生,不仅给畜牧业生产和肉品工业造成巨大的经济损失,而且严重威胁着人民群众的身体健康。旋毛虫病的临床表现症状一般不具典型特征,临床诊断较为困难,易与其他传染病相混淆。虽然肌肉活检发现幼虫或包囊虽可确诊,但在轻度感染早期往往不易检出,即使是感染晚期,因组织局限性的影响,活检阳性率也只有50%左右,且不易被人们接受。为此,寻找一种特异性强、敏感性高的诊断方法对旋毛虫病的防治具有重要意义。免疫学方法ELISA是目前最为敏感的方法,其敏感性可检测至每克肉0.01条虫体即每公斤肉含虫量少于10条,这一敏感性可完全确保肉类的安全,然而实验表明,用旋毛虫肌幼虫ES抗原为诊断抗原检测血清中抗旋毛虫抗体在感染2周后才可检出,而循环抗原(CAg)即排泄分泌(ES)抗原在最初几天就可检测到。因此,检测CAg是解决旋毛虫病早期诊断一个很有效的方法。为实现旋毛虫病的早期诊断,我们选用旋毛虫新生幼虫ES抗原作为筛选抗原,通过反复攻虫的免疫方法和单克隆抗体的制备技术获得了三株抗旋毛虫新生幼虫ES的单克隆抗体。通过免疫荧光实验我们发现这三株单克隆抗体可以与新生幼虫裸虫及感染早期的旋毛虫发生反应。证明我们所制备的单克隆抗体可以用于旋毛虫病的早期诊断。此外,我们还用所制备的单克隆抗体建立了旋毛虫病早期诊断双抗体夹心ELISA方法,为建立检测旋毛虫CAg早期诊断旋毛虫病的诊断试剂盒和试纸条奠定了基础。

论文目录

• 内容提要
• 前言
• 第一篇 文献综述
• 第一章 旋毛虫病诊断方法研究进展
• 1.1 酶联免疫吸附试验（ELISA）
• 1.2 免疫印迹技术（ＷESTERN–BLOTTING）
• 1.3 间接荧光抗体试验（IFAT）
• 1.4 斑点免疫金渗滤法
• 1.5 免疫聚合酶链反应法（IMMUNO-PCR）
• 1.6 DNA 检测技术
• 1.7 一步快速诊断试纸法
• 第二章 旋毛虫病诊断抗原的研究进展
• 2.1 虫体抗原
• 2.2 表面抗原
• 2.3 杆细胞颗粒相关抗原
• 2.4 旋毛虫排泄/分泌（EXCRETORY-SECRETORY，ES）抗原
• 2.4.1 ES 抗原的成分组成
• 2.4.2 ES 抗原在免疫诊断中的应用
• 2.4.3 ES 抗原在免疫预防中的应用
• 2.5 旋毛虫重组抗原
• 2.5.1 旋毛虫基因重组抗原在免疫诊断方面的研究
• 2.5.2 旋毛虫基因重组抗原在免疫预防方面的研究
• 第二篇 研究内容
• 第一章 人工感染旋毛虫昆明小鼠血清抗体动态变化研究
• 1.1 材料与方法
• 1.1.1 旋毛虫虫株
• 1.1.2 实验动物
• 1.1.3 试剂及耗材
• 1.1.4 液体配制
• 1.2 方法
• 1.2.1 抗原制备
• 1.2.2 血清制备
• 1.3 结果
• 1.3.1 抗原的制备
• 1.3.2 抗原包被量和二抗工作浓度的确定
• 1.3.3 三种不同的抗原检测旋毛虫感染小鼠血清抗体应答
• 1.4 讨论
• 1.5 小结
• 第二章 旋毛虫新生幼虫排泄分泌抗原单克隆抗体的制备及鉴定
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 旋毛虫新生幼虫ES 抗原的制备
• 2.2.2 免疫小鼠血清抗体效价的测定
• 2.2.3 细胞融合、杂交瘤细胞的选择性培养及单克隆抗体类型鉴定
• 2.2.4 杂交瘤细胞及单克隆抗体特性鉴定
• 2.2.5 腹水中单克隆抗体（IgG）的纯化和纯度测定
• 2.2.6 亲和力测定
• 2.2.7 特异性和交叉性检测
• 2.3 讨论
• 2.3.1 关于小鼠的免疫
• 2.3.2 关于细胞融合及培养
• 2.3.3 关于杂交瘤细胞株的筛选
• 2.3.4 关于杂交瘤细胞的克隆
• 2.3.5 关于单克隆抗体的纯化
• 2.3.6 关于单抗亲和力和特异性
• 2.4 小结
• 第三章 抗旋毛虫新生幼虫ES 单克隆抗体的免疫学定位研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果
• 3.2.1 免疫荧光染色检测三株单克隆抗体分别在旋毛虫不同发育时期的定位情况
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 第四章 旋毛虫病早期诊断双抗体夹心ELISA 方法的建立
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.2 结果
• 4.2.1 酶标反应板均一性检测
• 4.2.2 多抗最适包被浓度和单克隆抗体最适工作浓度的确定
• 4.2.3 多抗包被条件的确定
• 4.2.4 酶标二抗反应浓度的确定
• 4.2.5 酶标二抗反应时间的确定
• 4.2.6 底物反应时间的确定
• 4.2.7 敏感性检测
• 4.3 讨论
• 4.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 导师及作者简介
• 中文摘要
• ABSTRACT