抗T-2毒素和脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒素的抗体制备和T-2毒素酶联免疫分析检测方法的建立

论文摘要

单端孢霉烯族类毒素普遍存在于自然界中,主要由真菌产生。粮食在收获,运输,储存中被此类毒素污染的机率很高,带来了不可忽略的食品安全隐患。因此,建立一种方便、快速、可靠的检测方法来检测食品及谷物中毒素的含量是非常必要的。本研究的两种毒素T-2及DON （deoxynivalenol）毒素,分别是单端孢霉烯族类毒素A类和B类中重要的毒素,本文诣在建立其以ELISA为主的免疫学检测方法。（1）从禾谷镰刀菌的大米发酵产物中分离纯化到纯度为97.7%的DON毒素,将高速逆流色谱与高效液相色谱法有效地结合,从300 g大米发酵产物中获得8 mgDON毒素,用于和载体蛋白偶联。（2）通过DMAP （dimethylamiopryidine）催化法,合成了T-2-HS,通过碳二亚胺法与载体蛋白结合得到3种完全抗原,分别为T-2-HS-BSA, T-2-HS-OVA, T-2-HS-KLH,质谱鉴定其中的T-2-HS-BSA的偶联比为2.63。以T-2-HS-BSA免疫小鼠获得了高效价的抗T-2毒素多克隆抗体,建立了T-2毒素的间接竞争酶联免疫吸附检测方法。条件为：以20μg/mL的T-2-HS-KLH为包被原,封闭液为0.5%的卵清蛋白,多克隆抗体为一抗,标准品T-2毒素为竞争毒素。该方法的检测限为0.12μg/mL,线性范围0.28-30.84μg/mL, IC50值为1.45μg/mL,样品加标回收率为92.0%-104.6%,变异系数为15.1%-34.0%。（3）采用DMAP催化法,成功将DON的三个羟基位点乙酰化,并成功合成了混合免疫原DON-（HS）n-BSA及包被原DON-（HS）n-KLH,质谱结果显示免疫原的偶联效果较佳,免疫动物后获得了抗DON的多克隆抗体。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 第一章 文献综述
• 1.1 单端孢霉烯族毒素的概念,结构特征及来源
• 1.2 对动物和人类存在的主要危害
• 1.3 单端孢霉烯族毒素的国内外检测方法概述
• 1.4 单端孢霉烯族毒素的纯化分离方法概述
• 1.5 小分子物质与载体蛋白偶联概况
• 1.5.1 小分子物质完全抗原的常用偶联方法
• 1.5.2 偶联载体及佐剂的选择
• 1.5.3 偶联比对抗体产生的影响
• 1.5.4 完全抗原的鉴定方法
• 1.6 本课题研究的目的和意义
• 第二章 脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒素的制备与纯化
• 2.1 前言
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 菌株和培养基
• 2.2.2 实验器材
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 小麦禾谷镰刀菌的活化及形态学观察
• 2.3.2 小麦禾谷镰刀菌的活化
• 2.3.3 产毒培养
• 2.3.4 DON毒素粗提物的提取
• 2.3.5 DON毒素粗提物的纯化与鉴定
• 2.4 实验结果和分析
• 2.4.1 禾谷镰刀菌形态观察
• 2.4.2 高速逆流色谱
• 2.4.3 高效液相色谱
• 2.5 本章总结
• 第三章 抗T-2毒素抗体制备
• 3.1 前言
• 3.2 实验材料
• 3.2.1 主要试剂
• 3.2.2 主要仪器
• 3.2.3 主要溶液
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 T-2毒素合成T-2-HS的方法
• 3.3.2 T-2-HS合成的验证
• 3.3.3 T-2毒素完全抗原-免疫原T-2-HS-BSA的制备
• 3.3.4 MALDI-TOF-MS质谱鉴定完全抗原T-2-HS-BSA的合成
• 3.3.5 T-2毒素完全抗原-包被原T-2-HS-OVA的制备
• 3.3.6 动物免疫及其多克隆抗体的制备
• 3.3.7 间接ELISA最佳包被抗原浓度的确定
• 3.3.8 小鼠效价的测定
• 3.3.9 抗T-2毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立
• 3.3.9.1 Sp2/0细胞的复苏与传代培养
• 3.3.9.2 饲养细胞的制备
• 3.3.9.3 骨髓瘤细胞的制备
• 3.3.9.4 免疫脾细胞的制备
• 3.3.9.5 细胞融合及杂交瘤细胞的培养
• 3.3.9.6 阳性细胞孔的鉴定体系
• 3.3.9.7 阳性孔的克隆
• 3.3.9.8 第一次克隆后的阳性细胞孔的检测
• 3.3.9.9 包被原对阳性孔细胞筛选体系的影响的验证实验
• 3.4 实验结果和分析
• 3.4.1 T-2-HS LC/MS IT-TOF质谱鉴定结果
• 3.4.2 T-2-HS-BSA的MALDI-TOF-MS鉴定结果
• 3.4.3 ELISA的方阵法实验结果
• 3.4.4 小鼠多克隆抗体效价测定
• 3.4.5 细胞融合结果
• 3.4.6 第一次克隆化的阳性细胞转阴结果的分析
• 3.5 本章总结
• 第四章 DON多克隆抗体的制备
• 4.1 前言
• 4.2 实验材料
• 4.2.1 主要试剂
• 4.2.2 主要仪器
• 4.3 实验方法
• n的方法'>4.3.1 DON合成DON-（HS）_n的方法
• n的验证'>4.3.2 DON-（HS）_n的验证
• 4.3.3 DON的完全抗原制备
• 4.3.4 紫外扫描法验证2种完全抗原的合成
• n-BSA的合成'>4.3.5 MALDI-TOF-MS质谱鉴定完全抗原DON-（HS）_n-BSA的合成
• 4.3.6 动物免疫
• 4.3.7 多克隆抗体的制备及效价测定
• 4.3.7.1 间接ELISA最佳包被抗原浓度的确定
• 4.3.7.2 小鼠效价的测定
• 4.4 实验结果和分析
• 4.4.1 LC/MS IT-TOF质谱鉴定DON-（HS）
• 4.4.2 紫外扫描鉴定完全抗原的合成
• n-BSA的结果'>4.4.3 MALDI-TOF-MS质谱鉴定完全抗原DON-（HS）_n-BSA的结果
• 4.4.4 ELISA的方阵法实验结果
• 4.4.5 小鼠抗DON多克隆抗体的效价测定
• 4.5 讨论
• 4.5.1 DON完全抗原的合成
• 4.5.2 动物免疫注意问题
• 4.5.2.1 抗原乳化
• 4.5.2.2 免疫方式
• 4.6 本章总结
• 第五章 T-2毒素酶联免疫分析方法的建立
• 5.1 前言
• 5.2 实验材料
• 5.2.1 主要试剂
• 5.2.2 实验器材
• 5.3 实验方法
• 5.3.1 小麦中T-2毒素的加标回收实验
• 5.3.2 间接竞争ELISA法的初步建立
• 5.3.3 样品添加回收率的检测
• 5.4 实验结果和分析
• 5.4.1 T-2间接竞争ELISA标准曲线
• 5.4.2 加标回收实验结果
• 5.4.3 样品检测结果
• 5.5 本章总结
• 参考文献
• 致谢