血红素氧合酶/一氧化碳系统在妊娠期高血压疾病患者发病机制中作用的研究

论文摘要

第一部分血红素氧合酶和内源性一氧化碳在妊娠期高血压疾病患者胎盘组织中的作用目的:通过妊娠期高血压疾病孕妇胎盘组织中血红素氧合酶的表达和内源性CO含量测定,探讨血红素氧合酶/一氧化碳系统在妊娠期高血压疾病发病中的作用机制。方法:逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测40例妊娠期高血压疾病患者组（HDCP组）和15例正常晚孕妇女（对照组）胎盘组织中HO-1、HO-2mRNA的表达;HE染色观察胎盘绒毛及血管病变;免疫组化染色法检测胎盘组织中HO-1、HO-2的定位和表达,采用高清晰度彩色医学图文分析系统对其定量分析;分光光度法测定胎盘组织中HO的活性;Western blot检测胎盘组织中HO-1、HO-2蛋白质的表达;双波长定量测定法检测胎盘组织匀浆上清液碳氧血红蛋白（COHb）含量;硝酸还原酶法测定胎盘组织中NO代谢产物亚硝酸基/亚硝基（NO2-/NO3-）。结果:（1）HE染色可见妊娠期高血压疾病组胎盘绒毛数目减少、排列紊乱、细小血管壁增厚和管壁纤维素样坏死发生率显著高于正常妊娠组（P<0.01）。（2）HO-1蛋白主要定位于胎盘滋养细胞、间质细胞和血管内皮细胞,HO-2蛋白主要定位于胎盘滋养细胞及血管内皮细胞。（3）两组HO-1、HO-2mRNA表达均较强,正常妊娠组HO-1mRNA表达水平为1.13±0.19,子痫前期轻度、子痫前期重度及子痫患者HO-1mRNA表达量依次为1.34±0.7、0.68±0.4、0.72±0.3。（4）奸娠期高血压疾病组HO活性为（3.46±1.2）noml.mg-1.h-1,明显低于对照组（6.01±1.4）noml.mg-1.h-1（P<0.01）。（5）Westernblot显示两组在约32kd（HO-1）的位置均出现宽且较深的条带,正常组表达量121.86±4.2,妊娠期高血压、子痫前期轻度、子痫前期重度及子痫分别为（125.1±3.9、102.76±3.4、91.1±5.2、62.53±2.7）。（6）HDCP组胎盘组织COHb含量较对照组明显减少（P<O.01）。（7）HO-1mRNA、蛋白表达和HO活性以及胎盘组织COHb含量随妊娠期高血压疾病病情的加剧逐渐减少,组间比较有显著差异（P<0.05,P<0.01）。（8）正常妊娠胎盘均有HO-2mRNA和蛋白的表达,HO-2mRNA和蛋白表达量在HDCP组组间有下降的趋势,但无明显差异（P>0.05）。（9）妊娠期高血压疾病组孕妇胎盘组织中的NO2-/NO3-为（3.39±1.18）μmol/g,与对照组（17.69±3.53）μmol/g比较显著降低（P<0.01）。（10）胎盘组织中HO-1表达水平与胎盘组织CO浓度呈显著正相关（r=0.42,P<0.05）。结论:妊娠期高血压疾病患者胎盘HO-1蛋白表达、转录和活性下降,内源性CO生成减少,推测HO/CO系统可能参与了妊娠期高血压疾病发病过程。HO/CO与NO/NOS系统二者在胎盘功能中可能有协同和互补作用。第二部分HO/CO系统在人脐静脉内皮细胞中作用的实验研究目的:观察氯血红素（Hm）、二氯化钴（CoCl2）诱发化学缺氧和低氧培养模拟妊娠期高血压疾病体内内皮细胞缺氧环境对培养的人脐静脉内皮细胞血红素氧合酶表达和增殖,以及对细胞内游离钙离子浓度[Ca2+]i的影响。方法:体外培养人脐静脉内皮细胞,用氯血红素和原卟啉锌,以诱导和阻断HO-1的表达。通过逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和免疫细胞化学法检测HO-1、HO-2mRNA和蛋白的定位及表达;酶联免疫法检测培养上清液中碳氧血红蛋白（COHb）含量;MTT比色法和流式细胞技术检测人脐静脉内皮细胞增殖;RT-PCR观测CoCl2与血红素氧合酶表达间的量-效和时-效关系;荧光分光光度法观察常氧、低氧条件下,钙荧光探针（Fura-2/AM）负载培养的人脐静脉内皮细胞[Ca2+]i的变化。结果:（1）HO蛋白主要定位于在人脐静脉内皮细胞胞浆,HO-2的表达高于HO-1。（2）氯血红素显著诱导血管内皮细胞HO-1 mRNA、蛋白质的表达,同时促进细胞增殖和培养上清液中CO生成（P<0.05,P<0.01） （3） CoCl2和缺氧培养可诱导人脐静脉内皮细胞脐静脉内皮细胞增殖和上调血红素氧合酶的表达,促进内源性CO的产生,且与血红素氧合酶表达间表现出一定剂量和时间的依赖性（P<0.05,P<0.01）。（4）缺氧可促进[Ca2+]升高（P<0.05）。结论:Hm、CoCl2、缺氧培养诱导慢性缺氧促进人脐静脉内皮细胞增殖并上调血红素氧合酶-1和内源性CO,是保护内皮损伤的分子学基础。缺氧细胞内游离钙离子水平升高,可能与内源性CO共同参与血管张力的调节。HO/CO系统可能在妊娠期高血压疾病等心血管病的发生和发展中起重要作用。第三部分HO/CO系统对人脐静脉内皮细胞抗氧化应激损伤保护作用的实验研究目的:采用过氧化氢制作人脐静脉内皮细胞体外氧化应激损伤的细胞模型,通过缺氧预处理和氯血红素预处理,观察HO/CO系统对人脐静脉内皮细胞氧化损伤的影响。方法:观察各组细胞在光镜、电镜下形态和超微结构的改变;用台盼蓝排斥实验、MTT法检测了各组细胞活力;LDH释放量评价细胞损伤程度;并通过逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）观察其与血红素氧合酶表达间的关系。结果:（1）当H2O:浓度在500～1000umol/LH2O2组时,与对照组相比形态学的改变、细胞活力、LDH释放量有明显差异（P<0.01）,H2O2浓度在100～250umol/L时无明显统计学区别（P>0.05）。（2）缺氧、氯血红素预处理均可以诱导HO-1高表达,两者之间存在着浓度依赖性和时间依赖性关系,较对照组比较有显著差异（P<0.01）。（3）HO-1高表达能够增强人脐静脉内皮细胞抗氧自由基损伤的能力,表现为与损伤组相比,细胞生长状态好转、MTT水平、细胞存活率明显增加,LDH释放量明显减少,这种保护作用可以被HO-1的特异性抑制剂部分阻断（P<0.05,P<0.01）。结论:体外采用500umol/L过氧化氢为血管内皮细胞氧化损伤的最适宜浓度。缺氧、10umol/L氯血红素预处理对人脐静脉内皮细胞氧化应激损伤有明显的保护作用。第四部分MAPK信号传导系统在妊娠期高血压疾病中的调控及其与HO/CO系统的相互关系初探目的:ERK1/ERK2 MAPKs信号途径对缺氧和酸性成纤维细胞因子（aFGF）诱导的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）以及在妊娠期高血压疾病HO/CO系统中的调控作用。方法:aFGF或缺氧刺激人脐静脉内皮细胞,采用RT-PCR检测胎盘组织和人脐静脉内皮细胞HO-1mRNA表达水平;Western blot测定胎盘组织和人脐静脉内皮细胞ERK1/ERK1磷酸化水平;培养上清液和胎盘组织匀浆上清液中碳氧血红蛋白（COHb）测定;MTT比色法观察PD98059对细胞增殖的抑制作用。结果:（1）缺氧诱导人脐静脉内皮细胞HO-1mRNA表达水平和促进内源性CO的产生,缺氧36h后磷酸化ERK1/ERK2明显增高,其活性可被PD98059阻止。（2）aFGF可明显促进人脐静脉内皮细胞增殖和上调HO-1mRNA表达水平,PD98059可抑制其作用。（3）HO-1mRNA在妊娠期高血压表达强度较强（2.59±1.7）,子痫前期轻度、子痫前期重度依次为1.34±0.7,0.68±0.4。（4）HO-1mRNA及胎盘组织COHb含量随妊娠期高血压疾病病情的加剧逐渐减少,与正常组（1.13±0.19）比较有显著差异（P<0.05,P<0.01）。（5）正常妊娠磷酸化ERK1/ERK2蛋白相对表达量较弱（21.89±1.31）,但随HDCP病情进展,妊娠期高血压、子痫前期轻度、子痫前期重度表达量逐渐增加（61.79±1.87,116.2±2.29,97.88±3.48）,各组间有显著性差异（P<0.01）。结论:缺氧通过激活ERK1/ERK2信号传导途径,诱导HUVEC 110/CO系统的表达。ERK信号途径参与了aFGF介导的HUVEC增殖。表明ERKl/ERK2信号通路参与了妊娠期高血压疾病和人脐静脉内皮细胞HO/CO系统的信号传导过程。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 正文
• 第一部分 血红素氧合酶和内源性一氧化碳在妊娠期高血压疾病患者胎盘组织中的作用
• 第二部分 HO/CO系统在人脐静脉内皮细胞中作用的实验研究
• 第三部分 HO/CO系统对人脐静脉内皮细胞抗氧化应激损伤保护作用的实验研究
• 第四部分 MAPK信号传导系统在妊娠期高血压疾病中的调控及其与HO/CO系统的相互关系初探
• 综述
• 附录
• 致谢