论文摘要
狂犬病（rabies）是神经系统致死性疾病,发病后100%病死率,在我国引起的社会影响已经远远超过对于狂犬病毒（rabies virus,RV）本身的关注。然而,由于狂犬病毒的致病性与病毒基因组的遗传特性紧密相关,所以对狂犬病毒基因结构特征的研究是探讨狂犬病毒致病性及持续流行机理所不可缺少的。另外,由负链RNA病毒独特的复制特点所决定,在体外拯救重组狂犬病毒时,必须通过反式提供RNA依赖的RNA聚合酶（RNA dependent RNA polymerase,RdRp）功能。因此本研究利用RT-PCR技术,对狂犬病毒CTN181株（人用疫苗株的传代减毒株）全基因组进行分段扩增后,得到覆盖全基因组的21个首尾重叠的DNA片段,拼接后得到CTN181减毒株全长基因组核苷酸序列,并将L基因开放读码框（opening reading frame,ORF）进行了拼接和重组真核表达质粒的构建。结果表明,CTN181株全基因组序列（GenBank Accession No.EF564174）由11923个碱基构成,3’端到5’端依次排列着:3′端先导RNA（1～58）、N基因（59～1483）、P基因（1486～2475）、M基因（2481～3283）、G基因（3289～5355）、L基因（5380～11853）和5′端非编码尾部结构（11854～11923）,基因间隔区分别含有2、5、5和24个核苷酸。全基因序列种系发生分析表明CTN181属于基因1型狂犬病毒,与其它基因1型狂犬病毒株的核苷酸同源性在82.5%～84.7%之间,与分离自中国的野毒株BD06的同源性为87%。CTN181株全长序列和与其他已知的狂犬病毒全基因组序列进行比对分析发现:1)CTN181株在L基因起始处有两个连续的起始密码子ATG,这一点类似于蝙蝠中分离到的基因1型狂犬病毒;CTN181株成熟的G mRNA有一个比较长的5’端非编码区,这一现象有别于PV/SAD群狂犬病毒。2)在L蛋白和先导RNA中发现了一些潜在的功能位点;3)CTN181株与BD06株的同源性为87%,而aG株与BD06的同源性较低,从基因水平上说明CTN作为人用疫苗株要优于aG株;4)CTN181株五个编码基因和全基因组构建的进化树形状相似,提示狂犬病毒全基因组即各个基因在进化过程中比较保守,结构蛋白在功能上相互紧密联系,具有共进化的特征,提示每个基因在种系发生分析中起到相同的作用。在获得了全基因组序列的基础上,将狂犬病毒CTN181株完整L基因（从起始密码子到终止密码子）拼接在一起,并将其克隆到pVAX1真核表达载体上,构建成能够表达L蛋白（RdRp）的真核表达重组质粒pVAX1-L,为体外拯救重组狂犬病毒CTN181株反式提供聚合酶功能奠定了基础。综上所述,CTN181株完整序列的测定和分析以及L基因重组表达质粒的构建,对于构建狂犬病毒反向遗传系统以及进一步研究中国狂犬病毒流行株的分子生物学特点及其致病机制奠定了基础。