二甲亚砜通过作用于靶标RNA聚合酶提高转录活性

论文摘要

二甲亚砜在制药科学和细胞生物学领域是一种“万能溶剂”。二甲亚砜之前有报道称可以帮助以染色质或超螺旋结构的质粒为模板的RNA的体外转录。它的机制被认为是二甲亚砜改变了DNA模板的结构。在这篇文章里我们证实了低浓度的二甲亚砜显著的提高了以裸露的、短的PCR产物为模板的噬菌体RNA聚合酶催化的RNA合成反应,这表明二甲亚砜可以通过其他的机制提高转录效率。非常有意思的是,SP6噬菌体的RNA聚合酶对于二甲亚砜的刺激作用比T7噬菌体的RNA聚合酶敏感的多,这表明对于二甲亚砜作用于RNA的合成,RNA聚合酶是非常重要的靶标。与之相一致的是,我们的数据显示了二甲亚砜极为显著的提高了RNA聚合酶的活性,同时,并不改变RNA聚合酶对DNA模板的亲和性(K_M值)。RNA聚合酶活性的提高可以解释为酶蛋白结构的改变,这反映在二甲亚砜改变了酶蛋白的内源荧光波谱。而且,二甲亚砜同时提高了流产转录产物和全长转录产物的积累,其中流产转录产物的累积明显相对更多。因此,我们假设由二甲亚砜引起的RNA聚合酶结构的改变导致了聚合酶活性的提高,这种效应主要发生在转录起始阶段。二甲亚砜诱导的聚合酶的结构与功能的改变揭示了这些常用的溶剂的功能的一种可能的普遍的机制。

论文目录

• 郑重声明
• 摘要
• Abstract
• 第一章 背景介绍
• 1.1 酶在有机溶剂中的特性
• 1.2 二甲亚砜（DMSO）
• 1.2.1 DMSO的特性
• 1.2.2 DMSO在药理医学中的应用
• 1.2.3 DMSO在细胞和分子生物学中的应用
• 1.3 体外转录
• 1.3.1 体外转录特性
• 1.3.2 前人对DMSO对体外转录的影响的研究以及本工作的选题的目的
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 PCR模板与引物
• 2.1.2 主要用酶与药品
• 2.1.3 主要溶液的配制
• 2.2 方法
• 2.2.1 PCR扩增模板DNA
• 2.2.2 体外转录合成 RNA
• 2.2.3 蛋白质内源荧光检测
• 第三章 结果与分析
• 3.1 模板DNA的获得
• 3.2 低浓度DMSO显著提高线性DNA的转录，然而，高浓度DMSO抑制转录
• 3.3 改变RNA聚合酶DMSO刺激RNA合成的效率
• 3.4 DMSO改变RNA聚合酶的结构与作用于转录活性相一致
• 3.5 DMSO通过提高RNA聚合酶活性来激活转录
• 3.6 DMSO可能通过改变T7 RNA聚合酶的结构导致强烈增强转录反应的起始能力
• 3.7 温浴时间不同不改变DMSO影响转录的特性
• 3.8 DMSO作用于T7 RNAP可能的机制的模型
• 参考文献
• 本篇文章的工作的意义
• 研究生期间发表的论文及会议摘要
• 致谢
• 附录1 转录效应对Ca.intron折叠的影响
• 附录2 长的5’外显子提高Ca.I型内含子活性，而短的5’外显子抑制Ca.I型内含子活性
• 附录3 RNasin不是RNA分子伴侣
• 附录4 有机溶剂乙氰提高核酶Ca.LSU的自我剪接活性
• 附录5 有机溶剂促进体外转录