细胞分裂素和生长素调控拟南芥体细胞胚根端分生组织建立的分子基础

论文摘要

体细胞胚胎发生是植物发育过程中的特殊现象,指各种器官或组织的体细胞通过组织培养可以再生出类似于合子胚的结构——体细胞胚,进而发育成完整的植株。自从早期利用胡萝卜细胞培养体细胞胚的研究开始,这种独特的发育潜能已经成为细胞离体培养体系再生完整植株的重要手段,也成为研究植物胚胎发生早期形态建成调控机理的替代模型。因此,研究体细胞胚胎发生与发育的机理对于揭示细胞全能性与研究合子胚的形态发生等问题具有重要意义。目前,有关体细胞胚胎发生的分子机理和基因调控研究还很少,有待展开系统的研究。本实验室已有的实验结果指出生长素诱导WUS基因的表达对体细胞胚胎发生过程中茎端分生组织的重建是至关重要的。本文将从体细胞胚根端分生组织建成的机制以及microRNA（miRNA）影响体细胞胚胎发生的机理两个方面进行深入研究,期望研究结果为理解体细胞胚胎发生和发育的分子机理提供新的重要信息。主要研究结果如下:（1）细胞分裂素调控体细胞胚胎发生早期根端分生组织的建成为了研究体细胞胚胎发生过程中根端分生组织的重新建立情况,我们用激光共聚焦显微镜观察了根分生组织特征基因的表达模式。根端静止中心特征基因WUSCHEL RELATED HOMEOBOX 5（WOX5）最早在体细胞胚诱导16小时后开始表达,根端分生组织特征基因PLETHORA 2（PLT2）在诱导后24小时内就已经表达,之后SHORT ROOT（SHR）开始表达,而SCARECROW（SCR）开始表达的时间较晚,直到诱导2天后才检测到。雌激素诱导的pER8-WOX5 anti植株抑制了WOX5基因的表达,其胚性愈伤组织几乎丧失了再生体细胞胚的能力,而plt1-1 plt2-1双突变体的初级体细胞胚茎端虽形态正常并分化出两片子叶,但根端出现了严重的缺陷而且无法伸长。以上结果表明体细胞胚胎发生过程中根端分生组织特征基因的表达决定了体细胞胚根端分生组织的建立。在体细胞胚诱导的早期（14天）,表征生长素分布的DR5荧光信号无法在WOX5和PLT2表达区域被检测到;诱导5天后,体细胞胚已形成成熟的子叶,此时生长素的信号开始在根端分生组织特征基因的表达位置分布。这说明在茎端分生组织重新建成过程中起重要调节作用的生长素,在体细胞胚诱导早期并不分布在根端分生组织区域。施加细胞分裂素合成的抑制剂洛伐他丁导致胚性愈伤组织的胚性完全丧失而无法再生体细胞胚。进一步的实验发现,A类细胞分裂素响应调节因子ARABIDOPSIS RESPONSE REGULATOR 7（ARR7）基因的表达区域与PLT2一直重叠,细胞分裂素合成基因ISOPENTENYLTRANSFERASE 5（IPT5）的表达也向根端集中。而且利用细胞分裂素受体基因ARABIDOPSIS HISTIDINE KINASE（AHK）的双突变体ahk2 ahk4和ahk3 ahk4以及细胞分裂素响应调节因子35S::ARR7和35S::ARR15过量表达植株,抑制细胞分裂素的信号转导途径,会导致初级体细胞胚出现类似plt1-1 plt2-1双突变体根端缺陷的表型,次级体细胞胚的再生也出现异常。这说明细胞分裂素在体细胞胚胎发生早期特异的分布在根端分生组织区域,对胚的根端分生组织的建立起主要的调控作用。虽然生长素和细胞分裂素共同参与了合子胚顶-基轴的建立,但是与生长素和细胞分裂素协同调控体细胞胚纵向茎端-根端分生组织的建成的模式是不同的。生长素调控体细胞胚胎发生早期WUS的表达和茎端分生组织的形成,而细胞分裂素通过其信号转导途径调控WOX5的表达和根端分生组织的形成。（2）miR167通过其靶基因ARF6和ARF8调控体细胞胚胎发生植物中的miRNA是一类约21个核苷酸组成的内源非编码小分子RNA,通过与其靶基因mRNA互补配对结合,以抑制基因表达或切割mRNA的方式,实现对靶基因的负调控。近年来,越来越多的miRNA在植物生长发育过程中的功能和作用被揭示出来,我们也运用芯片技术检测在体细胞胚胎发生过程中差异表达的miRNA,并结合遗传学实验最终发现miR167在体细胞胚胎发生过程中起着重要作用。首先,我们发现过量表达miR167家族的成员miR167c会显著抑制体细胞胚胎发生。35S::miR167c的愈伤组织在培养过程中逐渐丧失胚性,仅能再生少量的体细胞胚,同时愈伤组织中的LEAFY COTYLEDON 1（LEC1）、LEC2和FUSCA 3（FUS3）等胚胎特征基因的表达水平也明显降低。进一步研究发现过量表达miR167c会导致生长素极性运输蛋白PIN-FORMED 1（PIN1）在愈伤组织中的极性定位消失,导致生长素极性分布模式无法形成,并使WUS基因表达模式紊乱,从而抑制了体细胞胚胎发生。另外,miR167c的靶基因AUXIN RESPONSE FACTOR 6（ARF6）和ARF8的突变体也导致体细胞胚的发生出现异常,arf6-2、arf8-3和arf6-2 arf8-3/+突变体诱导的体细胞胚再生频率明显降低。从表达模式上来看,miR167c及其靶基因ARF6和ARF8均在再生的体细胞胚中特异表达,也说明它们在体细胞胚的诱导过程中起作用。以上结果证明miR167是通过生长素响应因子ARF6和ARF8来调控生长素的极性运输及分布,进而影响体细胞胚茎端分生组织的建成。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 前言
• 1.1 植物的胚胎发生及其分子基础
• 1.1.1 植物胚胎发生的形态学研究
• 1.1.2 早期胚胎发生过程中极性的建立
• 1.1.3 胚胎区域形态建成的分子机理
• 1.1.3.1 根端起始和根端分生组织的建成
• 1.1.3.2 茎端分生组织的建成与子叶的分化
• 1.1.4 生长素调控胚胎发生的分子机理
• 1.1.5 细胞分裂素与生长素相互作用调控胚胎根端干细胞的分化
• 1.2 体细胞胚胎发生及其研究进展
• 1.2.1 体细胞胚胎发生
• 1.2.1.1 体细胞胚胎发生与合子胚胎发生
• 1.2.1.2 体细胞胚胎发生与植物激素
• 1.2.1.3 影响体细胞胚胎发生的其它因素
• 1.2.2 拟南芥的体细胞胚胎发生系统
• 1.2.2.1 叶肉细胞的原生质体诱导体细胞胚胎发生系统
• 1.2.2.2 茎端分生组织为外植体诱导体细胞胚胎发生系统
• 1.2.2.3 未成熟合子胚为外植体诱导体细胞胚胎发生系统
• 1.2.4 体细胞胚胎发生的分子调控机制
• 1.2.5 生长素诱导WUS 的表达调控体细胞胚胎发生过程中茎端分生组织的重新建立
• 1.3 MicroRNA 及其在植物生长发育中的作用
• 1.3.1 植物miRNA 的发现
• 1.3.2 植物miRNA 的生物合成
• 1.3.2.1 miRNA 前体的转录
• 1.3.2.2 miRNA 的剪切加工
• 1.3.2.3 双链miRNA 的甲基化及出核
• 1.3.2.4 miRNA 沉默复合体的形成
• 1.3.2.5 miRNA 的基因沉默作用
• 1.3.2.6 植物miRNA 的特点
• 1.3.3 miRNA 在植物生长发育中的作用
• 1.3.3.1 miRNA 靶基因的鉴定
• 1.3.3.2 miRNA 与植物的生长发育
• 1.3.3.3 miRNA 与植物激素及其信号转导
• 1.3.3.4 miRNA 与植物病害和胁迫响应
• 1.4 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料及生长条件
• 2.1.2 菌株和质粒
• 2.1.3 酶及生化试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 拟南芥体细胞胚再生培养
• 2.2.2 表达载体的构建
• 2.2.2.1 表达载体构建的基本过程
• 2.2.2.2 pER8 诱导型WOX5-anti 表达载体的构建
• 2.2.2.3 355 启动子驱动的miRNA 过量表达载体的构建
• 2.2.2.4 miR167c、ARF6 和ARF8 启动子驱动的GUS 表达载体的构建
• 2.2.3 农杆菌介导的拟南芥遗传转化
• 2.2.4 实时定量PCR 分析
• 2.2.5 原位杂交分析
• 2.2.5.1 材料的固定和包埋
• 2.2.5.2 切片
• 2.2.5.3 标记探针
• 2.2.5.4 脱蜡、消化、乙酰化、杂交和洗片
• 2.2.5.5 检测
• 2.2.6 GUS 染色分析和石蜡切片
• 2.2.7 共聚焦显微镜观察
• 2.2.8 microRNA 芯片分析
• 3 结果与分析
• 3.1 细胞分裂素调控拟南芥体细胞胚根端分生组织建立的分子基础
• 3.1.1 根分生组织特征基因在体细胞胚胎发生过程中的表达模式
• 3.1.1.1 WOX5 基因在体细胞胚发生过程中的表达分析
• 3.1.1.2 其他根端分生组织特征基因在体细胞胚发生过程中的表达分析
• 3.1.1.3 根分生组织特征基因在体细胞胚发生过程中的表达量变化
• 3.1.2 抑制WOX5 或PLT 基因的表达导致体细胞胚胎发生出现异常
• 3.1.4 生长素在体细胞胚胎发生的早期不在根端分布
• 3.1.4.1 生长素在体细胞胚胎发生的早期的分布模式
• 3.1.4.2 生长素合成基因在体细胞胚胎发生的早期的表达模式
• 3.1.5 细胞分裂素在体细胞胚胎发生早期特异的分布在根端分生组织
• 3.1.5.1 细胞分裂素响应调节因子ARR7 和ARR15 在体细胞胚胎发生早期的表达模式
• 3.1.5.2 ARR7 在体细胞胚胎发生早期特异的在根端分生组织区域表达
• 3.1.5.3 细胞分裂素合成基因IPT5 在体细胞胚胎发生早期的表达模式
• 3.1.6 改变细胞分裂素信号转导途径基因的表达导致体细胞胚胎发生出现异常
• 3.1.7 抑制细胞分裂素信号转导途径导致WOX5 的表达模式出现异常
• 3.1.8 体细胞胚胎发生早期茎端-根端极性的建立
• 3.2 miR167 在拟南芥体细胞胚胎发生过程中的功能研究
• 3.2.1 芯片技术分析在体细胞胚胎发生过程中差异表达的miRNA
• 3.2.2 过量表达miR167 家族成员导致体细胞胚胎发生频率显著降低
• 3.2.3 355::miR167c 体细胞胚胎发生过程中的基因表达模式
• 3.2.3.1 355::miR167c 体细胞胚胎发生过程中胚胎特征基因的表达
• 3.2.3.2 355::miR167c 中生长素梯度分布和WUS 表达位置出现异常
• 3.2.4 miR167c、ARF6 和ARF8 在体细胞胚胎发生过程中的表达模式
• 3.2.5 miR167 是通过调控其靶基因ARF6 和ARF8 表达来影响体细胞胚胎发生的
• 3.2.5.1 355::miR167c 体细胞胚胎发生过程中ARF6 和ARF8 的表达下降
• 3.2.5.2 ARF6 和ARF8 的突变体也导致体细胞胚胎发生频率明显降低
• 4 讨论
• 4.1 根端分生组织的建立也是体细胞胚发生的前提
• 4.2 细胞分裂素通过信号转导途径调控体细胞胚根端分生组织的建立
• 4.3 拟南芥体细胞胚胎发生的胚性起始和多细胞起源
• 4.4 激素调控拟南芥体细胞胚胎发生的模型
• 4.5 miRNA 在体细胞胚和合子胚发育过程中的作用机制
• 5 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读学位期间完成的学术论文