猪瘟RT-PCR ELISA诊断方法的建立及试剂盒的研制

论文摘要

猪瘟流行于全世界各养猪国家,严重危害养猪业的发展,是世界各国严格检疫防制的重点传染病之一。因此,有必要尽快建立一种能够应用于临床样本CSFV检测的快速、简便、标准化程度高的检测技术,并研制试剂盒,以满足畜牧业生产需要和市场需求。 本试验根据猪瘟病毒（CSFV）的5′-UTR设计特异性引物和捕获探针,用地高辛标记RT-PCR产物;再用生物素标记的探针在链亲和素包被的微量板孔中杂交捕获地高辛标记的PCR产物,建立RT-PCR ELISA方法。在RT-PCR ELISA诊断方法的建立过程中,主要进行了如下条件的选择:提取C株,石门强毒株以及病料的总RNA,并反转录;确定地高辛标记PCR产物的反应条件;检测酶标板的结合率;建立阴阳性判定标准;确定封闭剂最适工作浓度、链亲和素包被工作浓度、抗地高辛的过氧化物酶工作浓度;选择包被链亲和素和抗地高辛的过氧化物酶的最适浓度比,包被链亲和素和探针最适浓度比;确定地高辛标记产物和探针最适杂交条件;制备标准阳性对照;进行特异性试验、敏感性试验、保存期试验和田间试验等。试验所得结果如下:（1）封闭液为含0.2%BSA,0.1%Tween-20的PBS溶液;（2）链亲和素最适包被浓度为1:960;（3）酶标二抗最适浓度为1:3000;（4）探针最适浓度为1:80;（5）最适杂交条件为:37℃ 2小时;（6）不同种病毒间无交叉反应性;（7）敏感性比琼脂糖电泳检测高100倍以上等等。 通过RT-PCR ELISA方法对CSFV标准毒株（如C株,石门强毒株）和野毒感染进行检测,建立了一种特异性强、敏感性高、快速、简便且实用的非放射性检测CSFV的方法,为CSFV的分子流行病学调查和早期诊断提供了一条新途径。

论文目录

• 摘要
• 1.引言
• 1.1 概述
• 1.1.1 猪瘟的历史及危害
• 1.1.2 当前我国猪瘟的流行特点
• 1.2 病原学
• 1.2.1 形态结构
• 1.2.2 基因结构
• 1.3 流行病学
• 1.4 诊断
• 1.4.1 一般诊断
• 1.4.2 鉴别诊断
• 1.4.3 实验室诊断
• 1.5 相关领域国内外发展技术及趋势
• 1.6 研究的目的和意义
• 2.材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 病毒
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 溶液的配制
• 2.1.4 主要耗材
• 2.1.5 主要仪器设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 组织RNA的提取及反转录
• 2.2.2 Digoxigenin标记PCR产物
• 2.2.3 琼脂糖凝胶电泳检测
• 2.2.4 基因的克隆及测序
• 2.2.4 PCR-ELISA术式
• 2.2.5 工作浓度的确定
• 2.2.6.特异性试验
• 2.2.7 敏感性试验
• 2.2.8 检出率试验
• 2.2.9 田间试验
• 2.2.10 保存期试验
• 3.结果
• 3.1 地高辛标记RT-PCR.产物及克隆测序
• 3.1.1 病毒RNA的提取
• 3.1.2 地高辛标记PCR产物及电泳检测
• 3.1.3 克隆测序检测
• 3.2 PCR-ELISA各种工作浓度的确定
• 3.2.1 酶标板均匀性的检测
• 3.2.2 阴阳性判定标准的建立
• 3.2.3 封闭液以及工作浓度的确定
• 3.2.3 链亲和素工作浓度的确定
• 3.2.4 酶标二抗工作浓度的选择
• 3.2.5 链亲和素和抗地高辛的过氧化物酶最适工作浓度的确定
• 3.2.6 包被链亲和素和探针最适工作浓度的确定
• 3.2.7 杂交条件的确定
• 3.2.8 阳性样品的制备
• 3.2.9 特异性试验
• 3.2.10 敏感性试验
• 3.2.11 检出率试验
• 3.2.12 田间试验
• 3.2.13 保存期试验
• 4.讨论
• 4.1 建立RT-PCR-ELISA的理论依据及其应用意义
• 4.2 RT-PCR ELISA的优势及应用范围
• 4.3 RT-PCR ELISA方法的不足
• 4.4 试剂盒的研制
• 4.5 本试验方法的研究趋势
• 5.结论
• 参考文献
• 英文摘要
• 致谢