论文题目: 僵蚕抗凝活性部位的定量研究
论文类型: 硕士论文
论文专业: 中药学
作者: 赵建国
导师: 彭新君
关键词: 僵蚕,抗凝活性,凝胶色谱法,离子交换色谱法,成分分析
文献来源: 湖南中医药大学
发表年度: 2005
论文摘要: 目的研究僵蚕抗凝活性部位的制备工艺并进行定性和定量分析,以阐明抗凝的化学本质,为开发出临床实用的抗凝制剂提供基础。方法以凝血酶时间(TT)为指标,优选了抗凝活性部位的凝胶色谱法制备工艺。采用薄层色谱法(TLC)和定量化学分析方法如半微量凯氏定氮法、氨基酸自动分析法、高锰酸钾滴定法以及离子交换色谱法等对活性部位的化学成分进行定性、定量分析。采用添加法考察了草酸铵对僵蚕抗凝作用的影响。采用反相高效液相色谱／质谱法(RP-HPLC／MS)和阴离子交换色谱法对该活性部位进行了初步分离分析探索。结果抗凝活性部位的制备工艺为：30mL僵蚕粗提液加到用0.05mol/L NaCl的0.02 mol/L Tris-HCl(pH7.4)缓冲液平衡的SephadexG-25凝胶柱(φ2.6×80cm)上,用相同缓冲液洗脱,用自动分步收集器收集,2.5 mL/l Omin.管,收集TT≥100s的洗脱液即为抗凝活性部位。该活性部位TLC图谱显示有6个斑点,与甘氨酸和谷氨酸等17种氨基酸对照品溶液在相应位置上有相同颜色的斑点。固形物含量为4.31%,以蛋白质、多肽等含氮成分为主,总氮占总固形物的14.6%。换算成蛋白质约占总固形物的68.4%；其中氨基酸残基总量为2.10 g／100 mL,占固形物的48.70%。氨基酸残基中以谷氨酸含量最高,其次为丙氨酸和缬氨酸,分别为22.76%、14.97%和7.96%。草酸铵含量达0.42%,占总固形物的9.74%。RP-HPLC图谱显示有几个活性峰,其中峰2的活性较强,峰2的MS显示出一系列分子量接近的峰：1073、1223、1284、1346等添加1.8～21.3mg/mL的草酸铵溶液均能使僵蚕提取液(15.8～31.6mg/mL)和凝胶分离液(14.6-29.1 mg/mL)的TT延长,并具有统计学意义(相关系数检验P<0.01)。结论僵蚕抗凝活性部位的制备工艺可行。按选定的工艺制备的僵蚕样品具有明显的抗凝作用。该活性部位的主要成分是蛋白质、多肽等含氮化合物,实验中所采用的定性、定量方法准确、可控。TLC可作为这类成分的定性鉴别。经典化学方法包括半微量凯氏定氮法、氨基酸自动分析、氯化钙沉淀-高锰酸钾滴定法及离子交换法等可用于蛋白质和多肽、草酸铵、离子浓度等的定量测定。草酸铵对僵蚕提取液、凝胶分离样品的抗凝作用均有增强作用,提取液浓度越低,添加的草酸铵对其影响越大,而凝胶分离液浓度越大,对其影响也越大。
论文目录:
中文摘要
英文摘要
引言
实验研究
实验材料、仪器与试药
实验方法与结果
1 抗凝活性及其化学成分的预试验
1.1 供试品溶液制备
1.2 体外抗凝血活性评价
1.3 化学成分预实验
2 活性部位的制备工艺研究
2.1 抗凝活性评价指标选择
2.2 技术路线
2.3 工艺研究
2.3.1 药材选择
2.3.2 凝胶色谱分离研究
2.4 小结
3 抗凝活性部位的活性及其化学成分分析
3.1 鉴别试验
3.1.1 理化鉴别
3.1.2 UV吸收光谱
3.1.3 TLC鉴别
3.2 化学成分定量分析
3.2.1 固形物含量测定
3.2.2 草酸盐含量测定
3.2.3 可交换离子性物质浓度(mol/L)测定
3.2.4 具有离子交换特性的还原性物质的浓度(mol/L)测定
3.2.5 UV法测定蛋白质含量
3.2.6 总氮、酰胺态氮和铵态氮的含量测定
3.2.7 氨基酸种类及含量分析
3.3 体外抗凝血活性测定
3.4 草酸铵的抗凝活性研究
3.4.1 草酸铵的抗凝活性
3.4.2 添加草酸铵对抗凝活性的影响
3.5 小结
4 抗凝活性部位E的初步分离分析研究
4.1 HPLC/MS分离分析研究
4.2 离子交换色谱法分离
4.3 小结
讨论
1 关于抗凝活性评价指标及结果
1.1 凝血过程和机理
1.2 体外评价指标的选择及结果
1.3 动物实验评价的结果
2 关于活性部位的制备
2.1 Tris-HCl对抗凝作用的影响
2.2 凝胶色谱分离研究
3 关于活性部位成分分析
3.1 薄层色谱法鉴别
3.2 成分定量分析结果讨论
3.2.1 草酸铵的测定
3.2.2 离子浓度的测定
3.2.3 蛋白质和氨基酸的测定
4 草酸铵对僵蚕抗凝活性的影响
5 活性部位初步分离研究
5.1 活性部位的RP-HPLC/MS分离分析
5.2 活性部位的离子交换色谱分离
结语
致谢
参考文献
附录
1 发表文章目录
2 草酸按对僵蚕抗凝作用的影响
3 薄层色谱法分离僵蚕中蛋白质和 氨基酸类成分的研究
发布时间: 2010-07-15
参考文献
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