一株杆菌产脂肪酶基因的克隆及生物信息学分析

论文摘要

脂肪酶（EC3.1.1.3）全称为三脂酰甘油酰基水解酶,是一类催化油脂水解的水解酶,广泛存在于动物、植物和微生物,可催化酯交换、醇解、酯化酸解等反应,已广泛应用在食品加工、医学、洗涤业、纺织等领域。近年来,来源于微生物的脂肪酶的性质及其在工业的应用倍受关注,采用基因工程技术构建重组工程菌,提高相应脂肪酶的表达量,对相关工业的发展有着重大的意义。本课题从鞘氨醇杆菌Sphingobacterium. sp中克隆出脂肪酶基因片段,通过对其进行测序及生物信息学分析,希望对脂肪酶的应用提供理论依据。主要结论包括：1.用试剂盒法提取Sphingobacterium.sp基因组DNA,利用Primer Premier5.0软件设计特异引物,从Sphingobacterium.sp基因组DNA扩增脂肪酶基因片段,优化了扩增体系。2.用PCR技术从Sphingobacterium. sp基因组DNA扩增出一大约800bp的DNA片段Lip-J,与预期的大小相符。回收目的DNA片段并将其克隆到2EASY-Blunt Simple载体中,转化大肠杆菌JM109感受态细胞,获得重组质粒后再次进行特异性引物扩增鉴定后,证明重组质粒中含有我们扩增出的目的片段,将重组质粒送去测序。3将测序结果进行分析并构建进化树,分析结果表明Lip-J基因片段全长为761bp,正向插入到了pEASY-Blunt Simple载体中,含有一个长为639bp的开放阅读框。与其他菌的脂肪酶基因进行序列比对,与Bacillus subtilis脂肪酶基因一致性35.89%;与Bacillus stearothermophilus脂肪酶基因一致性为37.44%,综合结果可以得出Lip-J为脂肪酶基因片段。4将Lip-J基因片段进行生物信息学分析表明,其拟表达蛋白质的分子量为29416.9Da,等电点为5.12,为酸性蛋白质。负电荷残基（Asp+Glu）总数为27,正电荷残基（Arg+Lys）总数为24。不稳定系数为37.39,总平均亲水数为-0.381,为亲水性稳定型蛋白。结构预测表明该片段中α-螺旋占15.1%、β-折叠占34.0%、无规则卷曲占50.1%,无跨膜结构和信号肽存在。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 脂肪酶简介
• 1.2 脂肪酶的性质
• 1.2.1 脂肪酶催化反应的类型
• 1.2.2 脂肪酶的催化特性
• 1.2.3 脂肪酸特异性
• 1.2.4 脂肪酶的立体选择特异性
• 1.2.5 脂肪酶的固定化
• 1.3 脂肪酶的分子生物学研究
• 1.3.1 哺乳动物脂肪酶的研究
• 1.3.2 细菌脂肪酶的分子生物学研究
• 1.3.3 真菌脂肪酶的分子生物学研究
• 1.4 微生物脂肪酶的应用
• 1.4.1 脂肪酶的应用概况
• 1.4.2 脂肪酶在食品工业的应用
• 1.4.3 脂肪酶在纺织工业中的应用
• 1.4.4 脂肪酶在油脂水解中的应用
• 1.4.5 脂肪酶在洗涤工业中的应用
• 1.4.6 脂肪酶在造纸工业中的应用
• 1.4.7 脂肪酶在手性化合物制备中的应用
• 1.4.8 脂肪酶在医学中的应用
• 1.4.9 脂肪酶在生物柴油制备领域的应用
• 1.5 本课题的目的及研究意义
• 1.6 实验方案
• 第二章 脂肪酶基因片段的PCR扩增及鉴定
• 2.1 材料和试剂
• 2.1.1 菌株和载体
• 2.1.2 酶与试剂盒
• 2.1.3 培养基及试剂的配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 鞘氨醇杆菌Sphingobacterium.sp基因组DNA的提取
• 2.2.2 1%琼脂糖凝胶的制作
• 2.2.3 Sphingobacterium.sp基因组DNA琼脂糖凝胶电泳检测
• 2.2.4 Sphingobacterium.sp DNA的PCR扩增
• 2.2.5 PCR产物的纯化
• 2.3 结果与分析
• 2.4 讨论
• 2.4.1 Sphingobacterium.sp基因组DNA的提取
• 2.4.2 引物的设计
• 2.4.3 目的片段的回收
• 第三章 重组质粒的转化与鉴定
• 3.1 目的片段与pEASY-Blunt Simple Cloning载体的连接
• 2法）'>3.2 大肠杆菌JM109感受态细胞的制备（CaCl₂法）
• 3.3 转化
• 3.4 重组质粒的菌落PCR鉴定
• 3.5 重组质粒的提取
• 3.7 结果与分析
• 第四章 目的基因片段的生物信息学分析
• 4.1 前言
• 4.2 实验方法
• 4.3 目的基因的测序分析和拟表达蛋白结果预测
• 4.3.1 DNA序列分析与进化树构建
• 4.3.2 氨基酸序列分析
• 4.3.3 拟表达蛋白质理化性质的分析
• 4.3.4 跨膜区域的预测
• 4.3.5 二级结构的预测
• 4.3.6 信号肽的预测
• 4.3.7 三级结构的预测
• 4.4 结论
• 4.4.1 序列分析
• 4.4.2 蛋白质结果预测
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢