微生物絮凝剂HBF-3的剂型研究和vip3Aa基因对淡紫拟青霉的遗传转化

论文摘要

本研究主要进行了两个相互独立的工作：1微生物絮凝剂HBF-3的剂型研究絮凝剂HBF-3是由一株深海盐单胞菌V3a’（Halomonas sp. V3a’）产生的一种酸性多糖,具有较好的絮凝活性。为进一步开发利用该生物絮凝剂,本实验进行了剂型研究。以5%蔗糖为保护剂,采用冷冻干燥技术将发酵液制成固体剂型,冻干的HBF-3能够迅速复溶于水,絮凝活性为82.4%,维持了较高的絮凝活性。采用旋转蒸发浓缩,浓缩液稀释后的絮凝活性与初始发酵液相比,变化不大。对液体浓缩型絮凝剂添加1.0g/L山梨酸钾,样品在4℃、28℃、37℃、50℃储存一个月后能够保持90%以上的絮凝活性。2 vip3Aa基因对淡紫拟青霉的遗传转化淡紫拟青霉（Paecilomyces lilacinus）作为根结线虫（Meloidogyne spp.）、胞囊线虫（Heterodera spp.）等植物病原线虫的有效寄生菌,被认为是最有前途的植物病原线虫的生防真菌之一。Vip3Aa是苏云金芽胞杆菌在营养期开始表达的可溶性蛋白,对甜菜夜蛾和小地老虎具有很高毒力。本研究首次将vip3Aa基因转化到淡紫拟青霉基因组中,以获得既能防治根结线虫又能防治小地老虎等地下害虫的工程菌株。将vip3Aa基因克隆到pET28b（+）载体,并在大肠杆菌中表达,经纯化后得到Vip3Aa蛋白,以此作抗原免疫新西兰兔制备抗Vip3Aa多克隆抗体。分别以pcDNA3.1（-）和pcDNA3.1（+）为中间质粒,构建了vip3Aa基因的遗传转化载体puPVNT并将该质粒转化根癌农杆菌LB4404。以G418抗性基因为筛选标记,采用ATMT（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation）法实现了vip3Aa基因对淡紫拟青霉9410菌株的遗传转化。PCR检测证实,vip3Aa基因成功整合到淡紫拟青霉9410菌株的基因组中。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 第一部分 微生物絮凝剂HBF-3的剂型研究
• 1 前言
• 1.1 絮凝剂简述
• 1.2 微生物絮凝剂的研究现状
• 1.3 絮凝剂的后处理工艺
• 1.3.1 冷冻干燥
• 1.3.2 旋转蒸发浓缩
• 1.3.3 防腐剂储存
• 1.4 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌种及培养基
• 2.1.2 试剂与仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 HBF-3絮凝剂的发酵生产
• 2.2.2 冷冻干燥
• 2.2.3 旋转蒸发浓缩
• 2.2.4 絮凝剂的絮凝活性测定
• 3 结果与分析
• 3.1 冷冻干燥后成品活性分析
• 3.2 旋转蒸发浓缩对絮凝活性的影响
• 3.3 防腐储存
• 4 讨论
• 参考文献
• 第二部分 vip3Aa基因对淡紫拟青霉的遗传转化
• 1 前言
• 1.1 作物的线虫及地下害虫的危害及其防治
• 1.2 生防真菌淡紫拟青霉
• 1.2.1 淡紫拟青霉对作物线虫病的生物防治
• 1.2.2 淡紫拟青霉菌剂类型的研究
• 1.2.3 淡紫拟青霉菌作用机理研究
• 1.2.4 淡紫拟青霉菌种改良
• 1.3 苏云金芽胞杆菌营养期杀虫蛋白Vip3A
• 1.3.1 Vip3A研究现状
• 1.3.2 Vip3A蛋白作用机理研究
• 1.4 本课题的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株与质粒
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 试剂
• 2.1.4 仪器
• 2.1.5 溶剂与缓冲溶液
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 DNA操作
• 2.2.2 重组质粒的转化
• 2.2.3 根癌农杆菌介导的淡紫拟青霉遗传转化
• 2.2.4 转化子的Southern blot分析
• 2.2.5 蛋白质SDS-PAGE
• 2.2.6 抗体制备
• 2.2.7 Western blotting
• 2.2.8 PCR扩增
• 3 结果与分析
• 3.1 vip3Aa基因的克隆、原核表达和纯化
• 3.1.1 原核表达载体pVIP的构建
• 3.1.2 Vip3Aa蛋白的表达纯化
• 3.2 真菌表达载体puPVNT的构建
• 3.2.1 重组质粒pPVT的构建
• 3.2.2 重组质粒pPNT2的构建
• 3.2.3 重组质粒puPVNT的构建
• 3.3 质粒puPVNT转化农杆菌LB4404
• 3.4 农杆菌介导的遗传转化
• 3.5 淡紫拟青霉vip3Aa转化子的PCR检测
• 3.6 淡紫拟青霉vip3Aa转化子的Southern-blot分析
• 4 讨论
• 参考文献
• 致谢