鹅细小病毒结构蛋白基因遗传进化分析及其基因免疫研究

论文摘要

鹅细小病毒(goose parvovirus GPV)是细小病毒科(Parvoviridate)、细小病毒属(Parvovirus Genus)的成员。主要感染1月龄内雏鹅和雏番鸭以急性肠炎及肝、肾、心实质脏器炎症为特征的烈性传染病。该病危害程度与日龄密切相关,10日龄内雏鹅发病率和死亡率可达100%,在易感群中的致死率高达70℅,以后发病随日龄增大而逐渐减少。但近几年有报道称该病的发病日龄有增大趋势,超过30日龄的占14.3℅,这可能与鹅细小病毒毒力增强和基因变异有关。自1956年我国学者方定一首次发现并分离到病毒至今,国内外一直有分离到该病毒的报道,说明该病已经呈世界范围流行,对养鹅业发展威胁很大。该病毒可造成大鹅呈一过性隐性感染,不表现发病症状,但可带毒、排毒造成病毒的水平或垂直传播。目前本病的预防主要是采用疫苗进行免疫接种。小鹅除采用疫苗接种外,还要结合小鹅瘟高免血清进行紧急预防。因此寻找该病毒的毒力基因及抗原性基因遗传演化规律,筛选合适的疫苗进行有效防控;同时研制安全无毒有效的基因工程疫苗替代活苗免疫,将是逐步控制、消除本病的大趋势。本研究首先分离鉴定了黑龙江省鹅细小病毒发病地区的一株病毒,命名为GPVHG21,该毒株的ELD50值显示其为一强毒株。以GPVHG21株和两致弱疫苗株GPVHg1株、GPVHg2株为研究对象,分别克隆、测序三个病毒株的结构蛋白基因片段,共得到九个克隆片段,即GPVHG21VP1、GPV HG21VP2、GPVHG21VP3片段;GPVHg1VP1、GPVHg1VP2、GPVHg1VP3片段和GPVHg2VP1、GPVHg2VP2、GPVHg2VP3片段。之后采用DNAStar分子生物学分析软件,对上述三个毒株的共九个克隆片段进行比较分析。通过系统演化分析,揭示了GPV的遗传演化与地域因素的相关性规律;通过对GPVHG21株结构蛋白三个完整基因片段的抗原性预测图谱比较,发现在三段基因片段的非重叠区,也存在抗原性位点的信息;通过比较还发现GPVHg2疫苗株与GPVHG21分离株抗原性图谱更为接近,即采用以GPVHg2疫苗株去防治以GPVHG21毒株引发的鹅细小病毒病将更为合理有效。另外通过对强毒株GPVHG21和弱毒株GPVHg1、GPVHg2结构蛋白基因VP1序列的比较研究,发现了与GPV毒力强弱有关的基因位点,即VP1基因的第1611位和第2127位的核苷酸差异与毒株毒力强弱有关。此外以pcDNA5/TO为载体,以GPV HG21株的三个结构蛋白基因片段为研究对象,分别构建了三个结构蛋白基因片段的真核表达载体,近而搭建了进行结构蛋白基因免疫研究的平台,通过对三个真核表达质粒体外转染鹅胚成纤维细胞的体外表达检测和免疫小鼠、大鹅等动物的体内表达检测结果,说明三个真核基因表达质粒都可以在体外细胞中成功表达,并能诱发动物体内的体液免疫和细胞免疫两种形式的机体免疫反应。进一步为鹅细小病毒核酸疫苗的研究提供了理论依据。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 引言
• 1.1 鹅细小病毒概述
• 1.2 鹅细小病毒的特征
• 1.2.1 鹅细小病毒分类地位
• 1.2.2 鹅细小病毒形态结构和理化特性
• 1.2.3 鹅细小病毒宿主范围和培养特性
• 1.2.4 鹅细小病毒与番鸭细小病毒的关系
• 1.3 鹅细小病毒分子生物学研究进展
• 1.3.1 鹅细小病毒基因组结构
• 1.3.2 鹅细小病毒基因组的转录和复制
• 1.3.3 鹅细小病毒基因编码蛋白
• 1.4 鹅细小病毒病
• 1.4.1 鹅细小病毒病的流行病学
• 1.4.2 鹅细小病毒病的症状及病变
• 1.4.3 鹅细小病毒病的诊断与防制
• 1.5 鹅细小病毒病的防治及疫苗研究进展
• 1.5.1 鹅细小病毒常规疫苗
• 1.5.2 鹅细小病毒基因工程疫苗
• 1.5.3 鹅细小病毒高免血清和卵黄抗体
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 病毒鸭胚和细胞
• 2.1.2 引物合成
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 菌株载体与质粒
• 2.1.5 实验动物
• 2.1.6 主要仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 GPV 三毒株结构蛋白基因克隆及序列分析
• 2.2.2 pcDNA5\TO-GPVHG\21VP 的构建及体外表达
• 2.2.3 pcDNA5\TO-GPVHG\21VP 对小鼠免疫效果的研究
• 2.2.4 pcDNA5\TO-GPVHG\21VP 对鹅免疫效果的研究
• 3 结果与分析
• 3.1 GPV 三毒株 VP 基因克隆及序列分析
• 3.1.1 GPVHG\21 株的分离培养
• 3.1.2 GPV 三毒株VP1-VP3 基因的PCR 扩增
• 3.1.3 GPV 三毒株 VPpMD18-T 重组质粒的酶切鉴定
• 3.1.4 GPV 三毒株 VP1-VP3 基因的序列测定与分析
• 3.1.5 GPV 三毒株 VP1-VP3 基因及推导氨基酸的比较分析
• 3.2 pcDNA5\TO-GPVHG\21VP 的构建及体外表达检测
• 3.2.1 GPVHG\21 株VP1-VP3 基因的PCR 扩增
• 3.2.2 pMD18-T-HG\21VPb 的酶切鉴定
• 3.2.3 pcDNA5\TO-GPVHG\21VP 的酶切鉴定
• 3.2.4 pcDNA5\TO-GPVHG\21VP 的序列测定和比较
• 3.2.5 pcDNA5\TO-GPVHG\21VP 表达的免疫荧光检测
• 3.2.6 pcDNA5\TO-GPVHG\21VP 表达的电境观察
• 3.2.7 pcDNA5\TO-GPVHG\21VP 表达的RT-PCR 检测
• 3.3 pcDNA5\TO-GPVHG\21VP 对小鼠的免疫效果研究
• 3.3.1 鼠血清ELISA 抗体检测
• 3.3.2 鼠血清中和抗体检测
• 3.3.3 小鼠淋巴细胞转化实验
• 3.3.4 小鼠淋巴细胞IL-4 和 IFN-γ分泌水平检测
• 3.4 pcDNA5\TO-GPVHG\21VP 对鹅免疫效果的研究
• 3.4.1 大鹅血清抗体检测
• 3.4.2 小鹅免疫攻毒试验
• 4 讨论
• 4.1 GPVHG\21 株的生物学特性
• 4.2 GPV 三毒株结构蛋白基因的系谱分析
• 4.3 GPV 三毒株结构蛋白基因之间的差异分析
• 4.4 GPV 三毒株结构蛋白基因的抗原性预测分析
• 4.5 pcDNA5\TO-GPVHG\21VP 的构建与研究
• 4.6 pcDNA5\TO-GPVHG\21VP 的动物免疫研究
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 攻读博士学位期间发表的学术论文