蒺藜苜蓿ROP基因的克隆及功能研究

论文摘要

ROP GTPase是植物特有的一类小G蛋白，属于Rho亚家族成员。ROP GTPase信号在参与调控花粉管的极性生长、调节植物根毛极性发育方面承担关键性的作用。 根瘤菌与豆科植物建立共生关系过程中植物的管状结构—侵染线的形成也是一种极性生长。本研究目的就是寻找蒺藜苜蓿与根瘤菌共生固氮过程中参与侵染线发育的ROP基因，探索ROP GTPase在共生互作过程的调控作用。 应用生物信息学的方法，从蒺藜苜蓿的数据网站，检索到20个可能编码ROP基因的候选TC序列。根据TC序列设计引物，通过RT-PCR的方法，从蒺藜苜蓿中克隆到两个cDNA片段ROP2和ROP6，两个片段都包含全长594bp的ORF阅读框，编码197个氨基酸。同源查询及序列分析，发现ROP2和ROP6的氨基酸序列与拟南芥11个ROP蛋白同源性都达到50％以上；对两个基因在植物不同组织特异性表达分析，发现均没有明显的组织特异表达；缺N和盐处理也没有发现差异表达；根瘤菌侵染诱导后ROP2和ROP6均有增强表达。这些实验结果表明，ROP2和ROP6基因很可能参与豆科植物与根瘤菌共生过程的建立。 我们分别构建了ROP2和ROP6的植物表达载体，对蒺藜苜蓿进行遗传转化，GUS组织化学染色表明目标基因已经获得成功转化，为ROP基因进一步详细的功能研究打下基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一部分 文献综述
• 1 模式豆科—蒺藜苜蓿
• 2 小G蛋白
• 3 ROP GTPase在植物中的作用
• 4 ROP GTPase的结构特点
• 5 根瘤菌-豆科植物共生过程的建立
• 6 我们的工作
• 第二部分 实验论文
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 质粒及菌种
• 1.1.3 常用抗菌素
• 1.1.4 培养基
• 1.1.5 GUS染液
• 1.2 方法
• 1.2.1 无菌苗培养
• 1.2.2 盐胁迫处理
• 1.2.3 缺N处理
• 1.2.4 根瘤菌接种处理
• 1.2.5 RNA的抽提
• 1.2.6 RNA质量的检测
• 1.2.7 cDNA的合成
• 1.2.7.1 所用到的多对引物的合成
• 1.2.7.2 合成cDNA反转录体系（表2.3）
• 1.2.8 PCR扩增
• 1.2.9 PCR产物胶回收
• 1.2.10 PCR产物的连接转化
• 1.2.10.1 T-载体连接
• 1.2.10.2 DH5a感受态细胞的制备
• 1.2.10.3 连接产物的转化
• 1.2.11 质粒的提取
• 1.2.12 PCR鉴定目的基因
• 1.2.13 测序
• 1.2.14 生物信息学分析
• 1.2.15 农杆菌感受态的制备及转化
• 1.2.15.1 EHA105感受态细胞的制备
• 1.2.15.2 转化农杆菌
• 1.2.16 农杆菌的培养
• 1.2.17 蒺藜苜蓿遗传转化
• 1.2.17.1 侵染和共培养
• 1.2.17.2 抗性胚性愈伤组织的诱导
• 1.2.17.4 体细胞胚的诱导和培养
• 1.2.17.5 再生芽生根
• 2 结果与分析
• 2.1 RNA的抽提及质量分析
• 2.2 MtROP2和MtROP6的克隆
• 2.3 生物信息学分析
• 2.3.1 以拟南芥11个ROP基因序列筛选蒺藜苜蓿的EST数据库和TC序列
• 2.3.2 开放阅读框、功能位点、保守结构域分析
• 2.3.3 全长cDNA生物学分析
• 2.3.3.1 序列测定和可读框架分析
• 2.3.4 同源序列比较
• 2.3.5 蛋白质序列分析
• 2.4 ROP2和ROP6基因表达模式分析
• 2.4.1 组织表达特异性分析
• 2.4.2 缺N和0.1M NaCl处理结果
• 2.4.3 根瘤菌诱导处理
• 2.5 35S：：MtROP2和35S：：MtROP6植物表达载体的构建
• 2.5.1 35S：：MtROP2表达载体构建
• 2.5.2 35S：：MtROP6表达载体构建
• 2.5.3 MtROP2和MtRROP6重组质粒的检测
• 2.6 蒺藜苜蓿的遗传转化及再生
• 2.7 转基因植株的GUS组织化学鉴定鉴定
• 3 讨论
• 附录：本文所用到分子量Marker图谱
• 缩略语
• 参考文献
• 文章发表与参与科研项目
• 致谢
• 声明
• 原创性声明