映山红总黄酮对脑缺血再灌注损伤的保护作用及其机制

论文摘要

脑缺血性疾病是严重危害人类生命健康的常见病和多发病,具有很高的死亡率和致残率,但脑缺血的药物治疗效果却不尽如人意。因此,开发预防和治疗脑缺血损伤有效药物是国内外医药界特别关注的热点。映山红总黄酮（total flavonesof rhododendra,TFR）是从映山红中提取的主要有效部位,其主要成分包括金丝桃甙、槲皮素和映山红素等,有较强的抗心肌缺血损伤作用。但迄今为止,尚无对映山红总黄酮抗脑缺血作用的系统研究,因此,为加快开发利用映山红总黄酮,本研究将从整体水平、细胞水平评价TFR对局灶脑缺血再灌注损伤、全脑缺血再灌注损伤和海马细胞缺氧复氧损伤的保护作用,分析TFR与神经元缺血缺氧损伤后NOS mRNA表达、ERK和JNK通路、Ca2+和EDHF的关系。目的:观察TFR对小鼠和大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤是否具有保护作用,以及保护作用是否与脂质过氧化和NO有关。观察TFR对大鼠全脑缺血再灌注损伤是否具有保护作用,以及保护作用是否与ERK和JNK信号转导通路有关。在细胞水平,探讨TFR对大鼠海马神经元体外缺氧复氧的保护作用,以及TFR作用与Ca2+和EDHF的关系。方法:1.采用线栓法制作小鼠和大鼠大脑中动脉阻塞再灌注模型（middle cerebralartery occlusion,MCAO）,脑缺血2 h再灌注24 h后进行小鼠神经功能缺失评分;干湿法测定脑含水量;TTC染色显示大鼠再灌注后的梗塞灶,计算梗塞灶体积;测定血清和脑组织中LDH活力、MDA和NO含量及脑组织中SOD和GSH-PX活力;用RT-PCR法测定脑缺血再灌注后梗塞半球的iNOS、nNOS、eNOS mRNA表达的变化。2.采用Pulsinelli等介绍的四血管结扎法（4-vessel occlusion,4-VO）建立大鼠全脑缺血再灌注损伤模型。记录脑缺血前、缺血10 min和再灌注后5min、10 min、15 min、30 min、45 min、60 min的脑电图改变;采用HE染色法观察脑组织病理结构改变,进行脑组织病理评分;检测血清中LDH活性和NSE含量的变化;采用蛋白免疫印迹方法;测定大鼠脑皮质和海马组织中ERK1/2、p-ERK1/2、JNK1/2和p-JNK1/2在脑缺血再灌注后表达的变化,以及TFR对此变化的影响。3.采用大鼠原代培养的海马神经元缺氧4 h再复氧24 h模型。用MTT染色来评价神经元存活率;收集细胞上清液,进行LDH活性、NO和MDA含量测定;以Fluo-3/AM染色观察海马神经元内Ca2+的变化。4.在海马细胞缺氧前分别用脑血管段和脑微血管内皮细胞预处理,然后行海马神经元MTT染色率和上清液中LDH活性、NO含量的测定。结果:1.在小鼠MCAO模型上,TFR（30、60、120 mg/kg）能明显改善神经功能障碍（P＜0.05,P＜0.01）,明显降低缺血侧脑组织的含水量,使缺血侧脑水肿明显减轻（P＜0.01）,显著降低血清中LDH活性,MDA含量和NO含量（P＜0.05,P＜0.01）。2.在大鼠MCAO模型上,TFR（15、30、60 mg/kg）缺血再灌注半球梗塞体积百分比减小（P＜0.05）,使脑组织中LDH活性和MDA含量及NO含量下降,SOD和GSH-PX活性均升高（P＜0.05,P＜0.01）。3.在大鼠4-VO模型上,脑缺血时大鼠的脑电图幅度迅速下降,再灌注后脑电幅度逐渐恢复。TFR（15、30、60 mg/kg）在再灌注5 min时脑电图幅度与NS组比较无差异:在再灌注10 min、15 min和30 min时TFR（15、30、60 mg/kg）脑电图幅度尽管比NS组幅度高,但无统计学意义;再灌注45 min和60 min时,TFR（15、30、60 mg/kg）脑电图幅度与NS组比较有显著差异（P＜0.05,P＜0.01）。结果提示TFR可促进再灌注时大鼠脑电的恢复。同时TFR（15、30、60 mg/kg）能不同程度地改善脑缺血再灌注大鼠脑组织病理结构的改变,能减少血清中LDH的活力和NSE的含量（P＜0.05,P＜0.01）。4.在大鼠局部脑缺血2 h再灌注24 h模型上,30和60 mg/kg TFR可以显著增加脑组织eNOS mRNA的表达,降低脑组织iNOS mRNA和nNOS mRNA表达（P＜0.05,P＜0.01）,减少NO的生成。6.30和60mg/kg TFR对大鼠全脑缺血再灌注损伤脑皮质和海马组织ERK1/2和JNK1/2总体蛋白水平没影响,但对其激活产生了影响,促进ERK1/2信号通路的激活,抑制JNK1/2信号通路的激活。6.在大鼠原代海马神经元缺氧4 h复氧24 h模型上,TFR（10、20、40、80、160 mg/L）显著降低神经元的MTT染色和减少海马细胞LDH的漏出（P＜0.05,P＜0.01）,TFR（40、80、160 mg/L）显著减少上清液NO和MDA的含量（P＜0.05,P＜0.01）。7.在大鼠原代海马神经元缺氧4h复氧24h模型上,与模型组相比,TFR（10、20、40、80、160 mg/L）显著抑制海马细胞内钙离子的增加（P＜0.05,P＜0.01）,并呈一定的浓度依赖性。8.在大鼠原代海马神经元缺氧4 h复氧24 h模型上,TFR（10、20、40、80、160 mg/L）进一步升高加入脑血管段和脑微血管内皮细胞的海马神经元的活力,减少海马细胞LDH的漏出（P＜0.05,P＜0.01）,对NO的产生无影响;再加入Indo和L-NAME,神经元的活力和海马细胞LDH的漏出无进一步改变,NO产生减少。结论:1.TFR对小鼠和大鼠局部缺血再灌注损伤的脑组织具有保护作用。2.TFR对大鼠全脑缺血再灌注损伤具有保护作用。3.TFR可以提高海马神经元对于缺氧复氧的耐受性。4.TFR增加大鼠脑组织eNOS mRNA的表达,降低iNOS mRNA和nNOS mRNA表达,从而影响血清和脑组织中NO的含量;增加大鼠脑组织ERK1/2的激活,抑制JNK1/2在缺血再灌注后的激活;抑制海马细胞缺氧复氧时细胞内钙离子的增加;脑血管内皮,尤其是非NO和非PGI2,即假定的EDHF可能参与了TFR的作用。5.TFR作为抗脑缺血再灌注损伤的新药开发有潜在的临床应用价值。

论文目录

• 一. 英文缩略词表
• 二. 中文摘要
• 三. 英文摘要
• 四. 正文
• 引言
• 1. 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 1.3 统计学处理
• 2. 实验结果
• 2.1 TFR对小鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的影响
• 2.2 TFR对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的影响
• 2.3 TFR对大鼠全脑缺血再灌注损伤的影响
• 2.4 TFR对缺血再灌注损伤致NOS mRNA表达变化的影响
• 2.5 TFR对缺血再灌注损伤致ERK1/2激活的影响
• 2.6 TFR对缺血再灌注损伤致JNK1/2激活的影响
• 2.7 TFR对海马神经元缺氧/复氧损伤的影响
• 2.8 脑血管内皮因素介入TFR的保护作用
• 3. 讨论
• 3.1 TFR对局部脑缺血再灌注损伤的保护作用
• 3.2 TFR对大鼠全脑缺血再灌注损伤的保护作用
• 3.3 TFR对缺氧/复氧损伤海马神经元的保护作用
• 3.4 TFR在脑缺血再灌注损伤中抗氧化作用
• 3.5 TFR保护作用的NO机制
• 3.6 TFR对ERK1/2激活的影响
• 3.7 TFR对JNK1/2激活的影响
• 3.8 TFR保护作用的钙拮抗机制
• 3.9 脑血管内皮因素介入TFR的保护作用
• 五. 结论
• 六. 参考文献
• 七. 附录
• 八. 致谢
• 九. 综述
• 十. 参考文献