新Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1和3D编码基因的原核表达及抗3D蛋白单克隆抗体的制备

论文摘要

鸭病毒性肝炎（duck viral hepatitis,DVH）是一种由鸭肝炎病毒（duck hepatitis virus,DHV）引起的急性、高度致死性传播迅速的传染病,病死率高达100%,是鸭的五大传染病之一,对养鸭业造成严重危害。自从1945年在美国首次发现该病,其后世界多数国家相继报道本病的流行。1994年,在韩国首次发现新型鸭肝炎病毒（DHV-1C）。本试验对DHV-1C N株的编码结构蛋白的VP1基因和编码非结构蛋白的3D基因进行原核表达,并通过Western-blot检测其免疫活性,再利用纯化后的重组原核表达蛋白3D作为免疫原免疫小鼠,经过细胞融合,阳性筛选,杂交瘤细胞克隆化等步骤,成功制备1株抗DHV-1C的3D蛋白的单克隆抗体,为进一步对DHV-1C的VP1蛋白和3D蛋白的功能的研究和建立DHV-1C的快速诊断方法奠定了基础,并同时建立用于筛选的间接ELISA方法。根据DHV-1C全基因序列,应用Primer 5.0分析软件设计合成了扩增DHV-1C N毒株的VP1和3D基因的两对引物,在VP1基因引物中加入BamHⅠ和XholⅠ酶切位点,在3D引物中加入BamHⅠ和HindⅢ酶切位点,以DHV-1C N株RNA为模板,用这两对特异性引物分别扩增VP1和3D基因,分别将VP1和3D基因克隆入pMD-18T中,经酶切后,将带有酶切位点的片段克隆入pET-30a载体中,构建原核表达重组质粒BpET-30a-VP1-3和BpET-30a-3D-8,将其转入宿主菌E.coli BL21 （DE3）中诱导表达,SDS-PAGE和免疫印迹分析表明,重组原核表达蛋白VP1和3D分别在诱导3 h和4 h后表达量达到最高,VP1表达产物大小约为37.68 kDa,3D表达产物大小约为65.80 kDa,Western-blot分析显示二者都能与抗DHV-1C阳性血清产生特异性免疫反应,具有很好的免疫活性,可溶性分析显示,二者均以不溶性的包涵体形式存在于菌体中。以纯化的重组原核表达蛋白3D为免疫原腹腔皮下注射免疫BALB/c雌性小鼠,并作为包被抗原建立间接免疫酶联吸附（ELISA）方法。在加强免后第三天,取免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤SP2/0进行细胞融合,用已建立的间接ELISA方法筛选获得1株分泌抗DHV-1C的3D蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞,命名为2D9。经亚型鉴定,2D9的亚型为IgG1亚类,轻链为κ链。经Western-blot分析和间接ELISA检测,2D9具有很好的特异性识别抗原能力,与番鸭呼肠孤病毒σB蛋白无交叉反应,特异性良好,经Dot-ELISA分析,2D9能够识别天然构象蛋白,经免疫组化和免疫荧光检测,2D9与感染DHV-1C的细胞发生显色反应和免疫荧光反应,经间接ELISA测定,2D9细胞上清的效价为1:512,腹水效价为1:256 000,检测传代30次后细胞上清效价和冻存三个月后的复苏细胞上清效价,其分泌抗体的能力没有显著差异,表明稳定性良好。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 前言
• 1.1 鸭肝炎病毒的病原特性
• 1.2 鸭肝炎病毒分类地位
• 1.3 鸭肝炎病毒的致病性
• 1.4 鸭肝炎病毒的诊断方法
• 1.5 鸭肝炎病毒的基因结构及其功能
• 1.5.1 小RNA 病毒的基因组结构及其蛋白组成
• 1.5.2 Ⅰ型鸭肝炎病毒的基因组结构特点及其功能
• 1.6 Ⅰ型鸭肝炎病毒蛋白作用及其特性
• 1.7 新型鸭肝炎病毒主要特点
• 1.8 单克隆抗体的研究进展、检测优势及应用
• 1.9 本研究的目的意义
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 毒株与血清
• 2.1.2 载体与菌株
• 2.1.3 试验动物、细胞及抗原
• 2.1.4 主要试剂及工具酶
• 2.1.5 序列分析软件
• 2.1.6 引物设计软件
• 2.1.7 主要仪器
• 2.2 原核表达重组质粒的构建及鉴定
• 2.2.1 VP1 和3D 表达引物的设计
• 2.2.2 病毒RNA 的提取
• 2.2.3 RT-PCR 扩增及检测
• 2.2.4 PCR 产物的回收纯化
• 2.2.5 pMD18-T 载体克隆质粒的构建及鉴定
• 2.2.6 重组表达质粒的构建及鉴定
• 2.2.7 重组表达质粒在E.coli BL21 菌中的诱导表达及鉴定
• 2.2.8 重组蛋白3D 的纯化及鉴定
• 2.3 重组蛋白3D 的单克隆抗体的制备及鉴定
• 2.3.1 BALB/c 小鼠的免疫
• 2.3.2 间接ELISA 方法的建立
• 2.3.3 细胞融合
• 2.3.4 阳性杂交瘤细胞孔的筛选
• 2.3.5 阳性杂交瘤细胞的亚克隆
• 2.3.6 单克隆抗体的制备及纯化
• 2.3.7 单克隆抗体的鉴定
• 2.3.8 杂交瘤细胞的冻存和复苏
• 3 结果与分析
• 3.1 DHV-1C W 株VP1 和3D 基因的扩增
• 3.2 原核表达重组质粒的鉴定
• 3.2.1 原核表达重组质粒的酶切鉴定
• 3.2.2 原核表达重组质粒的PCR 鉴定
• 3.2.3 原核表达重组质粒的测序鉴定
• 3.3 表达产物的鉴定
• 3.3.1 表达产物的SDS-PAGE 电泳分析
• 3.3.2 表达产物的Western-blot 分析
• 3.4 纯化重组表达蛋白3D 的检测
• 3.5 间接ELISA 方法的建立
• 3.6 杂交瘤细胞株的建立
• 3.7 单克隆抗体的鉴定
• 3.7.1 单克隆抗体亚型鉴定
• 3.7.2 单克隆抗体的Western-blot 分析
• 3.7.3 单克隆抗体的DOT 分析
• 3.7.4 单克隆抗体的免疫组织化学分析
• 3.7.5 单克隆抗体的免疫荧光分析
• 3.7.6 单克隆抗体特异性检测
• 3.7.7 单克隆抗体效价测定
• 3.7.8 杂交瘤细胞分泌抗体的稳定性的测定
• 4 讨论
• 4.1 重组质粒BPET-30A-VP1-3 和BPET-30A-3D-8 的构建
• 4.2 重组质粒BPET-30A-VP1-3 和BPET-30A-3D-8 的表达
• 4.3 单克隆抗体的制备
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文