小球藻糖蛋白的分离纯化与体外预防肿瘤作用筛选的研究

论文摘要

小球藻是一种人工培养的营养保健品,含有多种营养成分。近年来的研究表明,小球藻热水抽提物和干粉具有抗肿瘤及其它多种生物功能,其中起主要作用的是糖蛋白提取物。但目前的研究主要集中在糖蛋白粗提物及其在动物的体内试验,对小球藻糖蛋白的分离纯化和预防肿瘤作用报道甚少。同时传统的肿瘤药物筛选方法是针对疾病或者针对化合物,只适合于随机筛选。本论文对小球藻糖蛋白进行了分离纯化,并根据肿瘤预防的机理建立一个快速、灵敏、高通量而又经济的体外细胞筛选模型,对小球藻糖蛋白预防肿瘤的作用进行了筛选,不仅对小球藻预防肿瘤药物的开发利用具有一定的理论意义和应用价值,同时也为筛选利用其它天然药物提供了借鉴作用。首先对小球藻糖蛋白进行了分离纯化。运用响应面分析确定了小球藻糖蛋白水提法的最佳提取条什:料水比1:21.9,在温度86.0℃下提取5.0 h;运用正交试验确定了Sevag法的最佳脱蛋白条件:样液与试剂比2:1,氯仿与正丁醇比4:1,脱蛋白次数3次,脱蛋白时间15 min;经Sephadex-75层析进一步纯化、透析、浓缩、冷冻干燥后,得到两种白色棉花状糖蛋白物质（CGPⅠ和CGPⅡ）。SephadexG-200凝胶柱层析证明CGPⅠ为均一组分,CGPⅡ组分不均一,高压凝胶过滤色谱证实CGPⅠ纯度为98.35%,CGPⅡ的纯度为78.84%。对小球藻糖蛋白CGPⅠ的化学组成进行了研究。通过SDS-PAGE,显示CGPⅠ呈现一条带,相对分子质量为63,700:氨基酸自动分析仪测定CGPⅠ含有全部17种氨基酸,并富含酸性氨基酸。气相色谱显示CGPⅠ主要单糖组成为葡萄糖、半乳糖、鼠李糖。紫外可见光谱分析显示CGPⅠ有蛋白质和糖吸收峰,没有核酸吸收峰;红外光谱分析表明CGPⅠ的糖苷类型为吡喃型。β-消去反应说明CGPⅠ糖组分和蛋白质组分是通过0-糖肽键连接的。测定了小球藻糖蛋白CGP I的体外抗氧化活性。通过清除羟自由基、超氧阴离子自由基、DPPH自由基、烷基自由基、还原力等试验,测定小球藻糖蛋白的抗氧化活性。结果显示,不同浓度CGPⅠ有一定的还原能力,且具有清除羟自由基、超氧阴离子自由基、DPPH自由基、烷基自由基的能力,其还原能力和清除自由基的能力与剂量有一定的效应关系。CGPⅠ消除羟自由基的能力高于Vc,其还原能力、清除超氧阴离子自由基、DPPH自由基、烷基自由基的能力均低于Vc。建立了体外筛选化学预防剂的转基因细胞模型筛选小球藻糖蛋白的肿瘤预防作用。应用重组PCR技术,从pRL-TK上扩增重组胸腺嘧啶核苷激酶（TK）启动子,并在其基本启动子上游创建特异性酶切位点SacⅠ。第一轮PCR获得500 bp和150 bp两个片段,第二轮PCR获得635bp的目的片段,克隆入pMD18-T载体中。而后扩增TK基本启动子克隆入pEGFP中构建载体pTK-GFP,并在其上游插入抗氧化反应元件（ARE）片段,构建pARE-TK-GFP。最后从以上两载体中扩增TK和ARE-TK目的片段克隆入载体pEGFP-N1中,构建最终表达载体pTK-GFP/neo和pARE-TK-GFF/neo。两表达载体分别用脂质体法转染HepG2细胞后,用800μg/ml G418筛选出细胞克隆HepG2-TK-GFP和HepG2-ARE-TK-GFP,在荧光显微镜下可见明显的绿色荧光。将阳性克隆细胞扩大培养,加入糖蛋白溶液,使其终浓度分别为0.32、1.6、8、40、200（μg/ml）,同时用PDTC和香菇多糖作阳性对照。结果显示,糖蛋白在200μg/ml时诱导效果最好,且糖蛋白浓度与GFP相对荧光强度存在剂量效应关系,而在对照克隆细胞中未发现与受试物有剂量效应关系。本研究从小球藻中分离得到一种糖蛋白,该糖蛋白具有抗氧化活性;根据肿瘤预防的抗氧化机理构建了一个带有抗氧化反应元件（ARE）和绿色荧光蛋白基因（GFP）载体的转基因细胞模型;小球藻糖蛋白能诱导ARE的顺式表达作用,促进GFP的荧光强度,并有剂量的依赖关系,说明小球藻糖蛋白具有预防肿瘤的作用。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 第一章 绪论
• 1.1 立题背景和意义
• 1.2 小球藻国内外研究进展
• 1.2.1 小球藻及应用状况
• 1.2.2 小球藻的药用价值
• 1.2.3 小球藻活性成分研究现状
• 1.3 小球藻糖蛋白研究概况
• 1.3.1 小球藻糖蛋白的提取
• 1.3.2 小球藻糖蛋白的性质及结构
• 1.3.3 小球藻糖蛋白的生物活性
• 1.4 化学预防剂筛选的研究状况
• 1.4.1 筛选方法的研究进展
• 1.4.2 体外细胞筛选方法
• 1.4.3 体外筛选方法的发展趋势
• 1.5 研究的目的和内容
• 1.5.1 研究目的
• 1.5.2 研究内容
• 参考文献
• 第二章 小球藻糖蛋白的分离纯化
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 主要材料
• 2.2.2 小球藻成分测定方法
• 2.2.3 多糖含量的测定
• 2.2.4 蛋白质含量的测定
• 2.2.5 小球藻糖蛋白提取的工艺流程
• 2.2.6 多糖得率的计算方法
• 2.2.7 小球藻糖蛋白水提工艺
• 2.2.8 小球藻糖蛋白脱游离蛋白工艺
• 2.2.9 凝胶柱层析
• 2.2.10 小球藻糖蛋白纯度鉴定
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 原料的基本组成含量
• 2.3.2 小球藻糖蛋白的水提工艺
• 2.3.3 小球藻糖蛋白脱游离蛋白
• 2.3.4 小球藻糖蛋白的柱层析
• 2.3.5 小球藻糖蛋白的纯度测定
• 2.4 本章小结
• 参考文献
• 第三章 小球藻糖蛋白（CGP Ⅰ）的化学组成研究
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 主要材料
• 3.2.2 CGP Ⅰ分子量测定
• 3.2.3 糖含量测定
• 3.2.4 蛋白质含量测定
• 3.2.4 氨基酸分析
• 3.2.5 单糖组成分析
• 3.2.6 紫外可见光谱（UV）分析
• 3.2.7 红外光谱（IR）分析
• 3.2.8 糖肽键测定
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 CGP Ⅰ分子量测定
• 3.3.2 CGP Ⅰ蛋白质组成
• 3.3.3 CGP Ⅰ糖组成
• 3.3.4 紫外可见光谱
• 3.3.5 红外光谱
• 3.3.6 糖肽键
• 3.4 本章小结
• 参考文献
• 第四章 小球藻糖蛋白抗氧化特性的研究
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 主要材料
• 4.2.2 试剂
• 4.2.3 还原力的测定
• 4.2.4 ·OH清除率的测定
• 2·清除作用的测定'>4.2.5 O²·清除作用的测定
• 4.2.6 DPPH自由基清除能力的测定
• 4.2.7 烷基自由基清除能力的测定
• 4.2.8 统计分析
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 还原力的测定
• 4.3.2 羟基自由基清除率的测定
• 2·自由基的清除作用的测定'>4.3.3 O²·自由基的清除作用的测定
• 4.3.4 DPPH自由基的清除能力的测定
• 4.3.5 烷基自由基清除能力的测定
• 4.3.6 小球藻糖蛋白抗氧化作用的机理
• 4.4 本章小结
• 参考文献
• 第五章 小球藻糖蛋白靶向作用真核表达载体的构建
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 质粒和菌株
• 5.2.2 试剂
• 5.2.3 主要试剂的配制
• 5.2.4 试验流程图
• 5.2.5 启动子的选择与克隆
• 5.2.6 绿色荧光蛋白（GFP）表达载体的构建
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 重组TK启动子的扩增
• 5.3.2 TA克隆的酶切鉴定
• 5.3.3 pTK-GFP和pARE-TK-GFP表达载体的鉴定
• 5.3.4 pTK-GFP/neo和pARE-TK-GFP/neo真核表达载体的鉴定
• 5.4 本章小结
• 参考文献
• 第六章 转基因细胞模型的建立及对小球藻糖蛋白预防肿瘤的初步筛选
• 6.1 引言
• 6.2 材料与方法
• 6.2.1 主要材料
• 6.2.2 试剂
• 6.2.3 主要试剂的配制
• 6.2.4 HepG2细胞的培养
• 6.2.5 转染用质粒的制备
• 6.2.6 脂质体法转染HepG2细胞
• 6.2.7 阳性克隆的筛选
• 6.2.8 转基因细胞中GFP荧光与DNA含量的检测
• 6.2.9 转基因细胞模型对糖蛋白的筛选
• 6.2.10 统计分析
• 6.3 结果与讨论
• 6.3.1 转基因细胞模型的建立
• 6.3.2 PDTC对GFP荧光诱导效果
• 6.3.3 香菇多糖对GFP荧光诱导效果
• 6.3.4 糖蛋白GFP Ⅰ对GFP荧光诱导效果
• 6.3.5 糖蛋白干预Ⅱ相酶预防肿瘤的机理探讨
• 6.4 本章小结
• 参考文献
• 主要结论
• 主要创新点
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢