拮抗植物病原真菌的海洋细菌筛选及其活性物质研究

论文摘要

对危害严重并难以控制的农作物病原真菌,急需寻找高效新型活性物质。在陆地寻找概率越来越低的情况下,本研究以油菜菌核病和棉花枯萎病病原真菌为指示菌,对1021株海洋细菌进行了抗菌筛选,从中得到了144株具抗菌活性的菌株,并对部分活性较好的假单胞菌株产活性物质进行了分子检测,同时详细研究了筛选得到的具有稳定拮抗油菜菌核病的海洋假单胞菌YZSN25和拮抗水稻纹枯病的海洋粪产碱杆菌WL24。分别对其抗作物病原菌谱,拮抗活性物质的分离、纯化和初步鉴定以及发酵培养条件进行了研究,结果如下：（1）在筛选的168个属中,活性菌株筛得率最高的属分别是芽胞杆菌属和假单胞菌属。筛选的1021株海洋细菌中包括海洋假单胞属菌株302株,得到了50株有活性的假单胞菌株。其中以不同来源的铜绿假单胞菌菌株筛选拮抗活性几率和拮抗活性最高。同时对筛选得到的部分活性较强的19株假单胞菌进行了活性物质的分子检测,分子检测结果显示：菌株1A06832和SH-46扩增获得了2,4-DAPG合成基因的目的片段；菌株1A04311、1A05429和1A01321扩增获得了吩嗪合成基因的目的片段；1A06832、1A00318和SH-46扩增获得了藤黄绿脓菌素合成基因的目的片段；而硝吡咯菌素合成基因片段没有获得。（2）筛选得到的海洋菌YZSN25,经生理生化鉴定和16S rRNA基因分子鉴定初步确认属于假单胞菌（Pseudomonas sp.）,具体的种仍需进一步实验确定,菌株连续传代10次遗传稳定性良好,其抑菌谱结果显示对油菜菌核病菌、水稻纹枯病、玉米小斑病菌、小麦赤霉菌、棉花立枯等植物病原真菌有较强的抑制作用。（3）菌株YZSN25活性物质理化性质研究表明：对热具有良好的稳定性,对酸碱不敏感,在酸性条件下可形成沉淀,复溶后仍然具有原来的活性；经紫外、蛋白酶、有机溶剂处理都显示了较好的耐受性。硫酸铵盐析活性组分分子量介于30 kDa-100 kDa之间,活性物质经固相萃取初步分离,由薄层层析实验进一步分离纯化,经水和茚三酮显色法初步确定为环脂肽类活性物质,同时获得两条Rf值分别为0.13（a）和0.29（b）的活性带,活性组分后又经高效液相色谱和质谱联用初步推测活性物质a和b可能为相同分子量的一类新型环脂肽类活性物质,其具体的分子量和结构有待进一步确定。（4）菌株YZSN25发酵培养基条件单因素优化实验初步确定了发酵条件组合：培养基初始pH值为自然pH值,种子液接种菌龄为12 h,接种量为3.0%,250 mL发酵摇瓶装液量为60 mL,发酵时间48 h,发酵温度28℃,摇床培养振荡频率为180r/min。对油菜菌核病离体叶片防治实验表明：活性物质粗提物的浓度为100μg/mL时对油菜菌核病的防治效果达到87.7%。（5）筛选得到海洋菌WL24,经生理生化鉴定和16S rRNA基因分析鉴定为粪产碱杆菌（Alcaligenes faecalis）,经连续传代10次抑菌活性稳定,其抑菌谱实验表明对水稻纹枯病、柿子炭疽病、玉米小斑病及蔬菜灰霉病等多种植物病原真菌有较强拮抗效果。（6）菌株WL24活性物质的理化性质研究结果表明：对热不具有较好的稳定性,60℃以上处理30 min活性下降迅速,对酸碱敏感在中性环境中较为稳定,对紫外处理敏感,经紫外光照射30 min时活性即下降37.2%,经蛋白酶K、胰蛋白酶、胃蛋白酶处理后,其相应的抑菌活性分别下降了31.6%、23.9%和21.3%。经测定活性物质在发酵周期为24 h达到最大值,而且抗菌活性的产生并不需要高浓度氯化钠的诱导。活性物质经硫酸铵盐析沉淀、凝胶过滤层析以及蛋白胶实验初步分离确定为分子量为40 kDa左右的蛋白。抗菌蛋白的生防实验及结构鉴定和抗菌机理的研究等相关工作有待进一步研究。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 抗植物病原真菌海洋细菌的筛选
• 1 文献综述
• 1.1 植物病害主要现状及生物防治现状
• 1.1.1 植物病害简介
• 1.1.2 生物防治简介
• 1.2 海洋微生物活性物质的研究进展
• 1.2.1 海洋活性物质主要来源
• 1.2.1.1 海洋细菌
• 1.2.1.2 海洋真菌
• 1.2.1.3 海洋放线菌
• 1.2.1.4 微藻
• 1.2.2 海洋活性物质主要分类
• 1.2.2.1 活性肽类化合物
• 1.2.2.2 大环内酯类化合物
• 1.2.2.3 生物碱类化合物
• 1.2.2.4 含卤化合物
• 1.2.2.5 其他类化合物
• 1.3 立题背景与意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 海洋细菌菌株
• 2.1.2 植物病原真菌
• 2.1.3 培养基
• 2.2 方法
• 2.2.1 植物病原真菌的活化与培养
• 2.2.2 海洋细菌的活化与培养
• 2.2.3 抗植物病原真菌海洋细菌的筛选
• 2.2.4 拮抗假单胞菌活性物质的分子检测
• 3 结果与分析
• 3.1 抗油菜菌核病的海洋细菌筛选结果
• 3.2 拮抗假单胞菌活性物质产生分析
• 4 小结与讨论
• 第二章 抗油菜核盘菌的海洋假单胞菌YZSN25活性物质初步研究
• 1 文献综述
• 1.1 油菜菌核病危害及生物防治现状
• 1.1.1 油菜菌核病的简介
• 1.1.2 油菜致病有关的酶与毒素
• 1.1.2.1 果胶酶类
• 1.1.2.2 纤维素酶和半纤维素酶
• 1.1.2.3 蛋白水解酶
• 1.1.2.4 其它酶类
• 1.1.2.5 毒素
• 1.1.3 油菜致病机制
• 1.1.4 油菜菌核病生物防治现状
• 1.2 假单胞菌防治植物病害研究进展
• 1.2.1 假单胞菌概述
• 1.2.2 假单胞菌产生的主要抗生素类型
• 1.2.2.1 硝吡咯菌素
• 1.2.2.2 2,4-二乙酰藤黄酚
• 1.2.2.3 藤黄绿脓菌素
• 1.2.2.4 吩嗪类
• 1.2.2.5 环状脂多肽
• 1.2.3 应用现状
• 1.2.3.1 在植物病害生物防治中的应用
• 1.2.3.2 作为微生物除草剂的应用
• 1.2.3.3 假单胞菌在害虫防治中的应用
• 1.3 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 海洋微生物菌种
• 2.1.2 供试病原菌
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 主要仪器和药品试剂
• 2.2 方法
• 2.2.1 YZSN25菌株的生理生化鉴定
• 2.2.2 YZSN25菌株的16S rRNA分子辅助鉴定
• 2.2.2.1 YZSN25菌株总DNA提取
• 2.2.2.2 YZSN25菌株16SrRNA的PCR扩增
• 2.2.2.3 YZSN25菌株系统发育树构建
• 2.2.3 YZSN25菌株的抗菌谱分析
• 2.2.4 YZSN25菌株传代稳定性测定
• 2.2.5 YZSN25菌株活性物质稳定性分析
• 2.2.5.1 对热稳定性测定
• 2.2.5.2 对酸碱稳定性测定
• 2.2.5.3 对紫外线稳定性测定
• 2.2.5.4 对蛋白酶稳定性测定
• 2.2.5.5 对有机溶剂耐受性测定
• 2.2.6 YZSN25菌株发酵培养条件初步优化
• 2.2.6.1 生长曲线的测定
• 2.2.6.2 盐度的影响
• 2.2.6.3 发酵培养基初始pH值的影响
• 2.2.6.4 装液量的影响
• 2.2.6.5 种龄的影响
• 2.2.6.6 接种量的影响
• 2.2.6.7 发酵温度的影响
• 2.2.6.8 发酵摇瓶转速的影响
• 2.2.7 YZSN25菌株活性物质分离纯化和鉴定
• 2.2.7.1 活性物质产生
• 2.2.7.2 活性物质提取方法初步确定
• 2.2.7.3 活性物质分子量大小的初步确定
• 2.2.7.4 硫酸铵分级盐析沉淀粗提取
• 2.2.7.5 固相萃取分离活性组分
• 2.2.7.6 薄层层析法对活性物质进行初步鉴定
• 2.2.7.7 活性物质的分子量和结构鉴定
• 2.2.8 活性物质粗提物对油菜菌核病的离体叶片防治实验
• 3 结果与分析
• 3.1 YZSN25菌株的形态学特征和生理生化特性
• 3.2 YZSN25菌株的分子鉴定结果
• 3.2.1 YZSN25菌株16S rRNA的PCR扩增结果
• 3.2.2 YZSN25菌株的系统发育树
• 3.3 YZSN25菌株的抗菌谱
• 3.4 YZSN25菌株传代稳定性
• 3.5 YZSN25菌株活性物质的稳定性
• 3.5.1 YZSN25菌株活性物质对热稳定性
• 3.5.2 YZSN25菌株活性物质对酸碱稳定性
• 3.5.3 YZSN25菌株活性物质对紫外线稳定性
• 3.5.4 YZSN25菌株活性物质对蛋白酶稳定性
• 3.5.5 YZSN25菌株活性物质对有机溶剂耐受性
• 3.6 YZSN25菌株发酵培养基初步优化结果-单因素法
• 3.6.1 生长曲线的测定
• 3.6.2 盐度的影响
• 3.6.3 培养基初始pH值的影响
• 3.6.4 装液量的影响
• 3.6.5 种龄的影响
• 3.6.6 接种量的影响
• 3.6.7 发酵温度的影响
• 3.6.8 发酵摇瓶转速的影响
• 3.6.9 单因素条件优化的确定及优化结果
• 3.7 YZSN25菌株活性物质分离纯化和鉴定结果
• 3.7.1 活性物质提取方法初步确定
• 3.7.2 活性物质分子量大小的初步确定
• 3.7.3 固相萃取分离活性组分
• 3.7.4 薄层层析法初步鉴定活性物质种类
• 3.7.5 活性物质的分子量和结构鉴定结果
• 3.7.6 活性物质粗提物对油菜菌核病的离体叶片防治效果
• 4 小结与讨论
• 第三章 抗水稻纹枯病的海洋粪产碱杆菌WL24活性物质初步研究
• 1 文献综述
• 1.1 水稻纹枯病危害及生物防治现状
• 1.1.1 水稻纹枯病的简介
• 1.1.2 水稻纹枯病的防治
• 1.1.2.1 化学防治
• 1.1.2.2 生物防治
• 1.1.2.3 选用抗性品种
• 1.1.2.4 农业防治
• 1.2 粪产碱杆菌综述
• 1.2.1 粪产碱杆菌简介
• 1.2.2 粪产碱杆菌常见活性物质
• 1.2.2.1 B-105
• 1.2.2.2 KalimantacinsA、B、C
• 1.3 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 海洋微生物菌种
• 2.1.2 供试病原菌
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 主要仪器和药品试剂
• 2.2 方法
• 2.2.1 WL24菌株的生理生化鉴定
• 2.2.2 WL24菌株的16S rRNA分子辅助鉴定
• 2.2.2.1 菌株总DNA提取
• 2.2.2.2 菌株16S rRNA的PCR扩增
• 2.2.2.3 WL24菌株系统发育树构建
• 2.2.3 拮抗菌株的抗菌谱分析
• 2.2.4 WL24菌株传代稳定性测定
• 2.2.5 WL24菌株活性物质稳定性分析
• 2.2.5.1 发酵液对热稳定性测定
• 2.2.5.2 发酵液对酸碱稳定性测定
• 2.2.5.3 发酵液对紫外线稳定性测定
• 2.2.5.4 发酵液对蛋白酶稳定性测定
• 2.2.5.5 生长曲线的测定
• 2.2.6 WL24菌株活性物质分离纯化和鉴定
• 2.2.6.1 活性物质产生
• 2.2.6.2 活性物质提取方法初步确定
• 2.2.6.3 活性物质分子量大小的初步确定
• 2.2.6.4 硫酸铵分级盐析沉淀粗提取
• 2.2.6.5 Sephadex G-100凝胶柱层析色谱
• 2.2.6.6 蛋白胶分离检测
• 3 结果与分析
• 3.1 WL24菌株的形态学特征和生理生化鉴定结果
• 3.2 WL24菌株的分子鉴定结果
• 3.2.1 WL24菌株16S rRNA的PCR扩增结果
• 3.2.2 WL24菌株的系统发育树
• 3.3 WL24菌株的抗菌谱
• 3.4 菌株WL24传代稳定性
• 3.5 WL24菌株活性物质稳定性分析
• 3.5.1 WL24菌株发酵液对热稳定性
• 3.5.2 WL24菌株发酵液对酸碱稳定性
• 3.5.3 WL24菌株发酵液对紫外线稳定性
• 3.5.4 WL24菌株发酵液对蛋白酶稳定性
• 3.5.5 WL24菌株的生长曲线
• 3.6 WL24菌株活性物质分离纯化和鉴定结果
• 3.6.1 活性物质提取方法初步确定
• 3.6.2 活性物质分子量大小的初步确定
• 3.6.3 Sephadex G-100凝胶柱层析分离结果
• 3.6.4 蛋白胶分离检测结果
• 4 小结与讨论
• 第四章 主要结论与展望
• 参考文献
• 致谢
• 硕士期间发表论文