来源于橄榄绿链霉菌A1的高比活木聚糖酶在植物中的高效表达

论文题目: 来源于橄榄绿链霉菌A1的高比活木聚糖酶在植物中的高效表达

论文类型: 博士论文

论文专业: 生物化学与分子生物学

作者: 杨培龙

导师: 姚斌

关键词: 橄榄绿链霉菌,高比活性木聚糖酶,转基因植物,烟草,马铃薯,块茎特异表达

文献来源: 中国农业科学院

发表年度: 2005

论文摘要: 木聚糖是一种由β-1,4-木糖苷键连接形成并带有多种取代基的多聚糖,大量存在于饲料植物的细胞壁中。木聚糖可以增加单胃动物消化道内的食麇粘性,降低动物对营养的吸收和饲料消化率,是重要的抗营养因子。木聚糖的降解可以通过内源性木聚糖酶和木糖苷酶完成。其中木聚糖酶可以将木聚糖降解成低聚木糖和木单糖,在饲料、制浆造纸、食品医药等行业中有着广阔的应用前景。目前木聚糖酶的生产主要在微生物发酵系统中进行,但是转基因植物可以提供一种经济、高效、安全且便于直接饲喂的重组酶生产方式。已经有几种微生物来源的木聚糖酶在烟草,大麦等植物中得到表达,但是酶的表达量和酶活性较低,不能满足工业生产的需要。 来源于橄榄绿链霉菌(Streptomyces olivaceoviridis)A1的木聚糖酶XYNB是一种性质优良的木聚糖酶,具有高比活性,已在饲料中作为添加剂应用。本研究首次进行高比活性木聚糖酶转基因植物的研究,并获得了具有高木聚糖酶活性的转基因植株。 首先克隆了块茎特异的马铃薯Patatin启动子以及马铃薯蛋白酶抑制剂Ⅱ信号肽序列,并构建了4种含有木聚糖酶的编码基因xynB的组成型和块茎特异性植物表达载体。 携带双35S启动子和AMV增强子的组成型表达载体被用于转化烟草。分子生物学检测确证了XYNB蛋白在细胞质和细胞间隙的高效组成型表达,表达的XYNB最高占烟草叶片总蛋白含量的6.8%。细胞内和分泌表达的木聚糖酶分子量均为21kD。转基因烟草中表达的木聚糖酶具有正常的生物学活性。木聚糖酶活性表现最高为170IU/g鲜叶片(23IU/mg总蛋白),是目前报道最高的水平。转基因烟草的叶片蛋白粗提液在不同温度处理后,仍保持木聚糖酶活性,具有稳定性。转基因植株可以正常生长和繁殖,具有遗传稳定性。 马铃薯(Solanum tuberosum L.)可以作为植物生物反应器的原料,具有易于转化、遗传稳定且成本低廉的优势,本研究首次利用转基因马铃薯进行组成型和块茎特异性木聚糖酶表达。PCR检测证实xynB基因整合入转基因植株的基因组中。RT-PCR,ELISA,SDS-PAGE以及Western Blotting分析表明转基因马铃薯可以组成型高效表达木聚糖酶XYNB,含量最高占叶片总蛋白含量的5%。细胞内表达的木聚糖酶分子量为21 kD,信号肽引导木聚糖酶分泌到细胞间隙表达,分子量为31kD,可能存在糖基化修饰。转基因马铃薯叶片蛋白提取液中可以表现木聚糖酶活性,最高为90 IU/g鲜叶片(10 IU/mg总蛋白)。木聚糖酶在马铃薯块茎中也有表达并表现活性,活性最高为13 IU/g鲜块茎。 利用Patatin启动子构建的马铃薯块茎特异植物表达载体,转化获得马铃薯再生植株并诱导块茎产生。RT-PCR,Western Blot及酶活性分析证明,xynB基因只在转基因植株的块茎中特异表达,且块茎特异表现木聚糖酶活性,活性最高为10 IU/g鲜块茎。 转基因马铃薯组成型表达的木聚糖酶具有一定的热稳定性。马铃薯植株具有遗传稳定性。研究的结果表明表达高比活性木聚糖酶的转基因马铃薯具有较高的应用价值。

论文目录:

中文摘要

ABSTRACT

第一章 引言

第一节 木聚糖酶及其基因工程

1.木聚糖及其结构

2.木聚糖酶(Xylanase)及其分子生物学

2.1 木聚糖酶分子的结构区域

2.2 木聚糖酶的理化性质

2.3 木聚糖酶基因及其克隆

3.木聚糖酶基因在原核生物中的的表达

4.木聚糖酶基因在真核微生物中的表达

5.木聚糖酶基因的改造

6.木聚糖酶的应用

6.1 在饲料行业中的运用

6.2 在造纸工业中的运用

6.3 在食品和医药行业中的运用

6.4 在酿酒行业及其它领域中的应用

第二节 利用转基因植物表达饲料用非淀粉多糖水解酶

1.葡聚糖酶和木聚糖酶的来源

2.β-葡聚糖酶和木聚糖酶的植物基因工程

2.1 β-葡聚糖酶转基因植物研究

2.2 木聚糖酶转基因植物研究

3 外源β-葡聚糖酶和木聚糖酶对转基因植物的影响

4 转基因植物饲喂动物的效果研究

5 问题与展望

5.1 转基因植物表达酶的表达量及其提高

5.2 外源酶与转基因植物的相互影响

5.3 转基因植物表达外源酶的性质

本研究的目的和意义

第二章 高比活性木聚糖酶XYNB在烟草中的表达

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

1.2.1 植物表达载体的构建

1.2.2 烟草的遗传转化

1.2.3 转基因烟草的PCR分析

1.2.4 转基因烟草的RT-PCR分析

1.2.5 转基因烟草的ELISA筛选

1.2.6 重组酶蛋白的SDS-PAGE以及Western Blot分析

1.2.7 重组酶的活性分析

1.2.8 重组酶的稳定性分析

1.2.9 分泌型重组酶的提取及酶活测定

2 结果与分析

2.1 马铃薯蛋白酶抑制剂Ⅱ信号肽序列的克隆与植物表达载体的构建

2.2 转基因植物的获得与ELISA筛选

2.3 转基因植株的PCR分析

2.4 转基因植株的酶活性分析

2.5 转基因植株的RT-PCR分析

2.6 转基因烟草重组木聚糖酶的SDS-PAGE和Western Blot分析

2.7 转基因烟草重组酶的稳定性分析

2.8 转基因烟草的遗传性初步分析

3 小结

第三章 高比活性木聚糖酶XYNB在转基因马铃薯中的组成型表达

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

1.2.1 植物表达载体的构建

1.2.2 马铃薯的遗传转化

1.2.3 转基因马铃薯的PCR分析

1.2.4 转基因马铃薯的RT-PCR分析

1.2.5 转基因马铃薯的ELISA筛选

1.2.6 重组酶蛋白的SDS-PAGE以及Western Blot分析

1.2.7 重组酶的活性分析

1.2.8 重组酶的稳定性分析

1.2.9 分泌型重组酶的提取及酶活测定

2 结果与分析

2.1 植物表达载体的构建

2.2 转基因马铃薯的获得

2.3 转基因植株的PCR分析

2.4 组成型表达木聚糖酶的转基因马铃薯的RT-PCR分析

2.5 组成型表达木聚糖酶的转基因马铃薯SDS-PAGE和Western blot

2.6 组成型表达木聚糖酶的转基因马铃薯酶活性分析

2.7 转基因马铃薯表达木聚糖酶的热稳定性分析

2.8 转基因马铃薯的遗传稳定性

3 小结

第四章 高比活性木聚糖酶XYNB在马铃薯块茎中的特异性表达

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

1.2.1 Patatin启动子的克隆与序列分析与植物表达载体的构建

1.2.2 马铃薯的遗传转化

1.2.3 转基因马铃薯的PCR分析

1.2.4 转基因马铃薯的RT-PCR分析

1.2.5 块茎蛋白质的提取

1.2.6 重组酶蛋白的SDS-PAGE以及Western Blot分析

1.2.7 转基因马铃薯块茎表达木聚糖酶的活性分析

2 结果与分析

2.1 Patatin启动子的克隆和序列分析

2.2 植物表达载体的构建

2.3 转基因马铃薯的获得

2.4 块茎特异表达木聚糖酶转基因马铃薯的RT-PCR分析

2.5 块茎特异表达木聚糖酶转基因马铃薯的SDS-PAGE和Western blot分析

2.6 块茎特异表达木聚糖酶转基因马铃薯的酶活性分析

3.小结

第五章 讨论

第六章 结论

参考文献

致谢

作者简历

发布时间: 2005-09-05

参考文献

• [1].痢疾志贺菌A1型IroN、ShuA单、双突变体的构建及功能分析[D]. 宾文.沈阳药科大学2006

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