烟草和杨树核基质附着区（MARs）的分离及其功能分析

论文摘要

核基质附着区　（Matrix　Attachment　Regions,　MARs）　是与核基质（或核骨架）特异结合的DNA 序列,属于非编码序列,富含AT。通过与核基质的结合,它能使染色质形成独立的环状结构,调控基因的转录,减少由于位置效应引起的转基因沉默。MARs在抑制转基因沉默、提高转基因表达水平、消除转基因个体间表达水平的差异等方面起着重要的作用。　本文采用两种不同的方法分别从烟草和欧洲黑杨中分离出MARs,并把它们构建到植物表达载体中,研究它们对转基因表达的调控作用。　以PCR 方法从烟草基因组中扩增到两个DNA 片段（M14 和M17）的序列分析表明,它们具有90%A-T　box,A-box,T-box,拓扑异构酶Ⅱ识别位点,自主复制序列（ARS,autonomously　replicating　sequences）,碱基非配对区（BUR,base　unpairing　region）,MAR 识别序列（MRS,MAR　recognition　sequence）,复制起始点（ORI,origin　of　replication）,弯曲DNA 序列（curved　DNA　motifs）等典型的MAR 序列特征。将它们分别构建到植物表达载体pCAMBIA2301　GUS 基因（uidA）表达盒一侧及两侧,通过农杆菌介导转化烟草。组织化学染色法定性检测GUS 活性表明,带有M14 和M17 的uidA 基因在转基因烟草中稳定表达。GUS 活性的定量检测表明,表达载体uidA 基因一端或两端连接有MAR 的转化烟草中,GUS 的表达水平与对照相比都有了明显提高,而uidA 基因两侧连有MAR 的载体其提高表达水平的效果优于一端连有MAR 的载体,可使GUS 活性增强3.14 倍,但不同转化个体之间表达水平的差异仍然明显。上述结果表明,所得DNA 序列为两条新的MAR 片段,并且具有提高转基因表达水平的功能。　采用高盐方法从欧洲黑杨悬浮细胞中分离到两个DNA 片段,并对它们的序列进行了详细的分析。发现它们具有MARs 序列的部分特征基元如:90%A-T　box,A-box,T-box,拓扑异构酶Ⅱ识别位点,自主复制序列,碱基非配对区,MAR 识别序列,复制起始点,弯曲DNA 序列等。将它们构建到植物表达载体pCAMBIA1305.1 中GUS 基因（uidA）表达

论文目录

• 第一章 文献综述 核基质附着区与转基因表达
• 1.1 关于转基因沉默
• 1.2 核基质与核基质附着区
• 1.3 Loop 结构模型的形成
• 1.4 MARs 的结构特征
• 1.5 MARs 与核基质的结合特征
• 1.6 MARs 的功能
• 1.6.1 边界因子作用
• 1.6.2 染色质调节作用
• 1.6.3 DNA 复制起始子的组分
• 1.6.4 染色体结构组成作用
• 1.7 MARs 对转基因表达的调控作用
• 1.7.1 MARs 提高转基因表达水平
• 1.7.2 MARs 降低转基因表达水平差异
• 1.8 探讨与展望
• 第二章 烟草 MARs 的分离及其功能分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 菌株、质粒、试剂、培养基和抗生素
• 2.1.2 烟草基因组 DNA 的提取
• 2.1.3 PCR 引物设计
• 2.1.4 聚合酶链反应（PCR）
• 2.1.5 PCR 产物的克隆和鉴定
• 2.1.6 大肠杆菌感受态的制备、转化
• 2.1.7 重组子的筛选、鉴定和保存
• 2.1.8 植物表达载体的构建
• 2.1.9 根癌农杆菌感受态细胞的制备
• 2.1.10 重组质粒的转化
• 2.1.11 烟草的转化及再生植株的筛选
• 2.1.12 GUS 活性的定性检测
• 2.1.13 GUS 活性的定量测定
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 烟草 MAR 片段的克隆和鉴定
• 2.2.2 烟草 MAR 序列的分析
• 2.2.3 植物表达载体的构建
• 2.2.4 定性分析报告基因的表达
• 2.2.5 烟草 MARs 对转基因表达的作用
• 2.3 讨论
• 2.3.1 M14 和 M17 序列特征的分析
• 2.3.2 M14 和 M17 对外源基因表达的调节作用
• 第三章 欧洲黑杨 MARs 的分离及其体内功能鉴定
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 菌株、质粒、试剂
• 3.1.2 培养基和抗生素
• 3.1.3 杨树悬浮细胞的培养
• 3.1.4 杨树细胞核的制备
• 3.1.5 杨树细胞核的镜检
• 3.1.6 杨树核基质的制备
• 3.1.7 杨树 MAR 片段的分离及克隆
• 3.1.8 植物表达载体的构建
• 3.1.9 根癌农杆菌感受态细胞的制备
• 3.1.10 重组质粒的转化
• 3.1.11 烟草转化及再生植株的筛选
• 3.1.12 GUS 活性的定性检测
• 3.1.13 GUS 活性的定量测定
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 杨树细胞核的镜检
• 3.2.2 杨树 MAR 片段的分离及克隆
• 3.2.3 克隆子的测序及序列分析
• 3.2.4 植物表达载体的构建
• 3.2.5 烟草的转化及再生植株的筛选
• 3.2.6 定量分析报告基因的表达
• 3.3 讨论
• 3.3.1 A7 和 A23 的序列分析
• 3.3.2 A7 和 A23 的功能分析
• 3.3.3 烟草 MARs 和杨树 MARs 的功能对比分析
• 3.3.4 从林木中分离出 MARs 的意义
• 第四章 结论
• 致谢
• 参考文献
• 作者简介