亲和毛细管电泳法测定二氢叶酸还原酶的活性及与氨甲蝶呤对映体反应动力学参数

论文摘要

亲和毛细管电泳（ACE）是高效毛细管电泳（HPCE）技术的一种分离模式,结合了物质之间的亲和作用和毛细管电泳分离的原理,主要是指在电泳过程中具有生物专一性亲和力的两种分子受体（receptor）和其配体（ligand）间,发生了特异性相互作用,形成了受体-配体复合物,通过研究受体或配体在发生亲和作用前后的电泳谱图变化,可获得有关受体-配体亲和力大小、结构变化、作用产物等方面的信息。目前ACE技术广泛应用于分子生物学和生物化学等研究领域,如核酸片段的特异性识别、蛋白相互作用、竞争性免疫分析、药物-受体和药物-蛋白作用研究等。通过改善被分析物的电泳迁移行为,可提高分析灵敏度、选择性和分辨率。二氢叶酸还原酶（DHFR）和氨甲蝶呤（MTX）手性对映体是本课题的主要研究对象。本论文首次用亲和毛细管电泳法测定DHFR活性及与MTX对映体反应动力学参数,观察MTX对映体对DHFR是否有立体选择性,为临床使用对映体药物时要考虑其在代谢过程中对关键酶的立体选择性提供线索。第一部分亲和毛细管电泳法测定二氢叶酸还原酶的活力二氢叶酸还原酶（DHFR）在还原型辅酶II（NADPH）的参与下,催化7,8一二氢叶酸（FH2）还原成5,6,7,8一四氢叶酸（FH4）,同时NADPH转化为NADP+。由于FH4作为一碳单位的载体,参与体内DNA、RNA以及蛋白质的生物合成,因而该酶对于生物体的新陈代谢有重要的作用。DHFR不仅与肿瘤细胞的繁殖和复制密切相关,而且在临床在使用化疗药物时DHFR发生变化是导致肿瘤细胞产生耐药的重要机理之一,所以研究DHFR的活性具有重要的现实意义。本研究采用亲和毛细管电泳技术测定DHFR反应动力学常数,选用DHFR、FH2、NADPH作为反应体系,通过调节电泳缓冲液的种类、离子强度、pH值、添加的表面活性剂的浓度、运行电压及毛细管的温度,优化出实现酶反应体系中各组分离的最适条件为含0.2%Brij-35的pH9.50的50 mmol/L硼砂缓冲溶液,分离电压25kV,分离温度25℃,进样压力0.5psi,进样时间10s,检测波长254nm,电流为174.3μA。结果表明亲和毛细管电泳可以在30min内实现DHFR反应体系中反应物和生成物的分离,观察不同底物浓度下的电泳图谱,利用反应物或者生成物峰面积的变化来研究在酶反应过程中反应物或者生成物浓度的变化,计算出二氢叶酸还原酶的Km值为6.05×10-7 mol/L·min,与其它文献报道一致。亲和毛细管电泳方法具有进样量少、操作简便、灵敏度高、易于分离和定量、检测速度快等优点,已被广泛地应用于生物体内酶活性的研究。第二部分亲和毛细管电泳法测定氨甲蝶呤对映体与二氢叶酸还原酶反应动力学参数氨甲蝶呤（MTX）是DHFR的强抑制剂,能与DHFR的活性部位发生可逆而牢固地结合,使该酶失活,它比叶酸对此酶的亲和力大105倍,因此MTX的抗肿瘤作用强而持久,是常见的肿瘤化疗药物之一。自然界中的MTX为手性对映体,存在L和D两种构型,分别为L-（+）-MTX和D-（-）-MTX,但这两种对映体药物的活性是否存在差异,国内外均未见相关报道。本研究亦采用亲和毛细管电泳技术,反应体系选用DHFR、FH2、NADPH的混合物,毛细管优化的分离条件同第一部分。将已知的L-（+）-MTX和D-（-）-MTX分别作用于所建立的DHFR体系,根据酶反应生成物峰面积的变化测定两种对映体的半数抑制浓度。观察不同浓度的氨甲蝶呤对映体L-（+）-MTX和D-（-）-MTX对DHFR抑制的电泳图谱,根据反应生成物NADP+峰面积的变化计算得出D-（-）-MTX的IC50为31.67×10-8 mol/L, L-（+）-MTX的IC50为2.48×10-8 mol/L,两者相差13倍左右,结果表明MTX两种对映体对DHFR抑制差异存在统计学意义,本方法用于MTX对映体与DHFR反应动力学参数的测定,每次反应总体积仅为100μl,2 ml的分离试剂,且在30min内能准确分离并定量反应物和生成物,与其它传统的方法以及高效液相色谱法相比,具有明显的优势。第三部分人非小细胞肺癌A549细胞中二氢叶酸还原酶的提取纯化用体外培养的人非小细胞肺癌A549细胞为实验对象,离心收集对数生长期的肿瘤细胞,超声破碎细胞离心提取上清液,上样于蛋白纯化仪,运用的是1.3cm×10cm DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析,从肺癌A549细胞中提取纯化得到DHFR。通过调节超声破碎的功率、间隔时间、次数以及离子交换层析柱平衡缓冲液的pH、KCl洗脱浓度梯度、洗脱的速度,得出纯化DHFR的最佳条件,收集洗脱的蛋白峰,进行12%SDS-PAGE垂直板电泳分析,根据标准分子量蛋白来统计条带的分子量。将含DHFR酶各管溶液冷冻真空干燥,-60 oC储存备用。DEAE-Sepharose Fast Flow利用离子交换和分子筛的原理,根据酶的等电点调节平衡缓冲液的pH值,以及控制流速充分利用其分离能力,可以用于细胞中DHFR的提取纯化。总结总之,亲和毛细管电泳技术可以用于DHFR活性以及与MTX对映体反应动力学参数的测定,首次检测出MTX对映体对DHFR抑制作用存在显著性差异。此方法具有试剂用量少、高灵敏度、成本低、干扰少、检测速度快及取样自动化等特点,在酶动力学研究研究领域中具有极为广阔的应用前景。但亲和毛细管仍然存在一些问题,我们在实验中发现毛细管内表面和物质间的吸附是电泳过程中的主要问题,其直接影响到动力学研究的准确性、分离的效率以及实验的重复性。

论文目录

• 中英文缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一部分 亲和毛细管电泳法测定提取纯化的二氢叶酸还原酶活性
• 1 前言
• 2 实验原理
• 3 材料和方法
• 4 结果
• 5 讨论
• 6 结论
• 7 参考文献
• 第二部分 亲和毛细管电泳法测定二氢叶酸还原酶与氨甲蝶呤对映体反应动力学参数
• 1 前言
• 2 材料和方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 5 结论
• 6 参考文献
• 第三部分 人非小细胞肺癌 A549 细胞中二氢叶酸还原酶的提取纯化
• 1 实验原理
• 2 材料和方法
• 3 实验结果
• 4 讨论
• 5 结论
• 6 参考文献
• 附录
• 致谢
• 综述
• 参考文献