γ-secretase抑制剂阻断Notch信号通道抗胶质瘤新生血管的作用研究

论文摘要

第一部分：Delta-like ligand 4在胶质瘤中的表达及临床意义目的：Delta-like ligand 4 （DLL4）为Notch受体的配体,表达于血管内皮细胞上,本研究旨在探讨DLL4在脑胶质瘤中的表达及与微血管密度（Microvessel density,MVD）的关系。方法：收集脑胶质瘤标本40例,分三组（Ⅰ级12例,Ⅱ级13例,Ⅲ-Ⅳ级15例）,分别使用DLL4单克隆抗体、抗人CD31多克隆抗体行免疫组织化学染色,Image-Pro Plus 6.0软件分析DLL4光密度（optical density, OD）半定量分析DLL4表达,统计微血管数。结果：各组DLL4蛋白OD值为Ⅰ级514.71±179.56,Ⅱ级961.97±88.53,Ⅲ-Ⅳ级1125.31±225.35,p<0.01；MVD值Ⅰ级24.75±10.33,Ⅱ级57.62±12.45,Ⅲ～Ⅳ级114.60±25.28,p<0.01。DLL4的OD值与MVD的相关系数为γ=0.68（p<0.01）。结论：DLL4表达随胶质瘤恶性程度的升高逐步增加,与微血管密度密切相关,对判断胶质瘤的恶性程度及血供有指导意义。由于阻断DLL4的方法均难以在临床上有效应用,而γ-secretase抑制剂可特异性阻断DLL4的特异性受体Notch受体,以下我们将对γ-secretase抑制剂在抗胶质瘤新生血管上的作用及其机制展开研究。第二部分：γ-secretase抑制剂对血管内皮细胞的作用目的：研究表明Notch信号通路在血管生成及功能发育中有重要的作用。本研究旨在探讨y-secretase抑制剂阻断Notch信号通路后对血管内皮细胞VEGFR及细胞增殖的影响。方法：1×106小鼠微血管内皮细胞H5V置于含5μmol/Lγ-secretase抑制剂DAPT的培养液中培养6小时,设相同浓度的溶剂DMSO为对照组,6小时后收集蛋白以Western blotting测定NICD、Hes1、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3蛋白含量；收集RNA测定VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3的mRNA含量；1×104 H5V细胞分别置于含DMSO, DMSO+VEGF-A164, DAPT,或DAPT+VEGF-A164的培养液中培养,DAPT及VEGF-A164终浓度为5μmol/L和10ng/ml,每24小时更换培养液,72小时后以细胞分析计数仪计数细胞数目。结果：5μmol/L DAPT能有效抑制NICD、Hes1的蛋白表达,阻断Notch信号通路；DAPT组血管内皮细胞VEGFR1蛋白表达量下调,mRNA量是对照组的29%；VEGFR2蛋白表达上调,mRNA量为对照组的3.16倍；DAPT和DMSO组VEGFR3蛋白及mRNA表达无明显差别。DAPT与VEGF合用能促进H5V细胞增殖,细胞数较VEGF组及对照组明显增加,而单独应用则无促进作用。结论：y-secretase抑制剂能有效阻断Notch信号通路；y-secretase抑制剂通过调节VEGF受体表达影响VEGF信号通路；y-secretase inhibitor增强VEGF对血管内皮细胞的增殖作用。第三部分：y-secretase抑制剂影响血管功能发育抑制胶质瘤生长目的：胶质瘤是颅内恶性程度极高的常见肿瘤,本课题旨在研究y-secretase抑制剂在胶质瘤抗血管治疗中的作用及机制。方法：10×106胶质瘤U87MG细胞溶于200μl无血清DMEM中,皮下注射裸鼠背部皮下构建胶质瘤肿瘤模型,1周后DAPT（100mg/kg/day）皮下注射给药,以相同量DMSO皮下注射设为对照组,每5日测量肿瘤大小,25日后处死裸鼠,免疫组织化学染色测定肿瘤VEGF、VEGFR1、VEGFR2表达量,CD31抗体染色测量肿瘤血管密度、血管大小；模型裸鼠尾静脉注射15mg/kg荧光染料Hoechst33342,1分钟后处死,荧光定量肿瘤灌注情况；模型裸鼠处死前1小时腹腔注射60mg/kg缺氧探针Hypoxyprobe-1,处死后取肿瘤以Monoclonal anti-Hypoxyprobe antibody免疫荧光测量肿瘤缺氧情况。以Image-Pro Plus 6.0 software作半定量数据分析。结果：实验组VEGFR1表达量较对照组减低,VEGFR2较对照组升高,而VEGF表达量两组间无明显差别；实验组血管密度为对照组的2.45倍,而血管较细小,肿瘤灌注Hoechst 33342面积明显减少,缺氧面积明显增加,肿瘤大小较对照组明显下降,两组间统计学差异明显（P<0.01）。实验组血管管腔中充填有增生的内皮细胞样异常细胞,而对照组则未发现此类异常细胞在管腔中存在。结论：γ-secretase抑制剂促进肿瘤血管发生,却抑制肿瘤血管的功能发育,通过打破血管发生与功能发育的协调,抑制胶质瘤的生长。因此,γ-secretase抑制剂有望成为胶质瘤抗血管治疗的新药物。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略词表
• 前言
• 参考文献
• 第一部分 Delta-like ligand 4在胶质瘤中的表达及临床意义
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第二部分:γ-secretase抑制剂对血管内皮细胞的作用
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第三部分:γ-secretase抑制剂影响血管功能发育抑制胶质瘤生长
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 全文总结
• 综述一
• 参考文献
• 综述二
• 参考文献
• 在读期间发表论文
• 致谢