乐果对单胺类神经递质的影响

论文摘要

乐果（Dimethoate）是中国最常用的有机磷农药（OPs）之一。有机磷急性中毒救治是一个重大医学课题，国家十五攻关将迟发性神经病变和中间肌无力综合症治疗列为重要攻关内容。有机磷中毒的主要原因是乙酰胆碱酯酶（AChE）的磷酸化，其活性的丧失造成乙酰胆碱（ACh）在神经突触处的过量积聚，进而乙酰胆碱受体（M样和N样）过度兴奋，引起一系列中毒症状。虽然针对M胆碱受体（阿托品）、乙酰胆碱酯酶（肟类复能剂）和对症处理，在有机磷农药中毒救治中起了重要作用，也积累了丰富的经验，但中毒的病死率仍处于相当高的水平，一些问题急需研究，例如有机磷中毒的有些临床症状震颤、癫痫涉及非胆碱能机制多巴胺（DA）神经递质的异常变化，因而关注有机磷农药对单胺类神经递质的影响具有重要意义。 与有机磷中毒有关的单胺类神经递质具有一系列重要生理功能。例如，去甲肾上腺素（NE）增加具有升压和升高体温作用，又具有降压和心率减慢作用，还能增加食欲等，NE减少会增加痛感等。肾上腺素（E）主要是升压作用。多巴胺（DA）与帕金森症（Parkinson disease，PD）和精神分裂症有关，DA神经系统还参与调节脑垂体激素的分泌、心脑血管功能、中枢性催吐、胃肠道的蠕动、眼内压调节和视网膜信息的传递等。NE和5-羟色胺（5-HT）递质系统还与阿尔采默型老年痴呆（Alzheimer’s disease）有关。此外，5-HT与多方面的生理功能有关，包括睡眠、行为和记忆、下丘脑-垂体前叶功能、疼痛感受、体温调节、摄食和心血管功能调节。 由于单胺类神经递质具有一系列重要生理功能，因此研究乐果对单胺类神经递质的影响，有助于进一步探讨乐果的神经毒性机制，对于改善乐果中毒病人的临床治疗具有重要意义。而目前国内外在此方面只有对有机磷战争毒剂索曼（soman）的研究报告，发现其可以影响中枢神经系统其它神经递质，如儿茶酚胺的变化以及相应受体变化。虽有研究提示，有机磷酸酯可以影响单胺类神经递质，但这些变化的规律并不完全清楚。 因此，本文针对乐果影响单胺类神经递质影响作用机制进行了深入研究。首先建立递质检测方法。采用ODS柱，通过对流动相的组成、配比和pH进行实验研究，在不加离子对试剂条件下发现柠檬酸三钠、磷酸氢二钠和甲醇为最佳组合，流速1.0ml／min，建立一种快速准确测定大鼠血清及脑组织中单胺类神经递质去甲肾上腺素（NE）、肾上腺素（E）、多巴胺（DA）、5-羟色胺（5-HT）含量和多巴胺-β-羟化酶（DβH）活性的高效液相色谱电化学检测方法。又通过对流动相的组成优化实验研究，发现柠檬酸三钠、磷酸氢二钠和乙腈为最佳组合，建立一种快速准确测定大鼠脑片及其培养液中多巴胺及其代谢物的高效液相色谱电化学检测方法。通过线性试验、回收试验、精密度试验以及样品的测定，验证了方法的可行性。 观察乐果染毒对大鼠大脑分区单胺类神经递质去甲肾上腺素（NE）、肾上腺素（E）、多巴胺（DA）和5—羟色胺（5-HT）浓度变化的影响，对乐果中毒机制作进一步的探讨。雄性SD大鼠随机分为对照组（生理盐水）、低（38.9mg／kg）、中（83.7mg／kg）、高（180mg／kg）四个剂量组，腹腔注射染毒，给药后0.5h、2h、8h、24h断头处死并分离脑组织（大脑皮层、纹状体、海马、脑干和小脑五部分）。用正丁醇、正庚烷、高氯酸、三氯甲烷处理脑组织样品，用高效液相色谱电化学检测法检测。结果发现：不同时程的染毒组（低、中、高剂量组）大脑DA及其代谢物3，4二羟苯乙酸（DOPAC）、5-HT、NE和E的浓度与对照组相比均有显著性差异（P＜0.05）。变化规律非常复杂，在不同时程、不同剂量呈现不同方向的变化。DA及其代谢物DOPAC在纹状体分别增加了27—122％、89—538％；DA在其它分区变化没有显著性差异，DOPAC在大脑皮层有的剂量和时程增加了50—72％、有的剂量和时程减少了31—51％；在海马没有显著性差异；在脑干有的剂量和时程增加了4—102％，有的剂量和时程减少了10—16％；在小脑有的剂量和时程增加了6—39％，有的剂量和时程减少了6—23％。5-HT的浓度在纹状体减少了4—15％；在大脑皮层增加了34—169％；在海马有的剂量和时程增加了33—62％，有的剂量和时程减少了28—58％；在脑干增加了11—172％；在小脑有的剂量和时程增加了13—328％，有的剂量和时程减少了15—40％。NE的浓度在纹状体减少了18—70％；在大脑皮层有的剂量和时程增加了2—8％，有的剂量和时程减少了5—11％；在海马有的剂量和时程增加了7％，有的剂量和时程减少了8—24％；在脑干有的剂量和时程增加了3—20％、有的剂量和时程减少了8—16％；在小脑减少了4—23％。E的浓度在纹状体减少了7—45％；在大脑皮层减少了14—37％；在海马减少了33—56％；在脑干有的剂量和时程增加了4—8％、有的剂量和时程减少了7—33％；在小脑减少了4—19％。DA、DOPAC、NE、E和5-HT的浓度在不同时程的低、中、高剂量组间均有显著性差异（P＜0.05）。DA、DOPAC和5-HT浓度有随染毒剂量和时程的增加而增加的趋势，相反NE和E浓度有随染毒剂量和时程的增加而减少的趋势，存在剂量时程效应关系。因此乐果的中毒存在非胆碱能机制，即单胺类能机制，在临床上单胺类神经递质异常变化所引起的中毒症状应给予必要的关注。 研究发现：乐果对血清单胺类DA、DOPAC、5-HT、NE、E浓度有影响，不同时程的染毒组（低、中、高剂量组）血清DA及其代谢物DOPAC和5-HT的浓度比对照组分别增加了8.42—296％、13—67％和3.2—27％。不同时程的染毒组血清NE和E的浓度比对照组分别减少了9.58—55.4％和11—32.6％。DA、DOPAC、NE、E和5-HT的浓度在不同时程的低、中、高剂量组间均有显著性差异（P＜0.05）。DA、DOPAC和5-HT浓度有随染毒剂量和时程的增加而增加的趋势，相反NE和E浓度有随染毒剂量和时程的增加而减少的趋势。 通过体外和体内乐果染毒对大鼠大脑纹状体和血清DβH活性的影响试验，发现乐果对大鼠大脑纹状体和血清DβH活性有抑制效应，与对照组相比，染毒组纹状体和血清DβH活性下降6—59％。体外试验有剂量反应关系（r=-0.8912），体内试验有剂量效应（r=-0.9967）和时程效应（r=-0.9134）。乐果对大鼠体内DβH活性的抑制作用，会造成去甲肾上腺素与肾上腺素合成障碍，体内去甲肾上腺素与肾上腺素减少或缺失，同时体内多巴胺增多，导致血压调节紊乱，血管扩张，血压下降，必然引起一系列的病理反应。 通过体外和体内乐果对大鼠大脑纹状体和血清MAO酶活性的影响试验，发现乐果对大鼠大脑纹状体和血清MAO酶活性没有抑制作用。 体外离体脑片染毒实验证实：乐果对单胺类神经递质DA及其代谢物DOPAC、高香草酸（HVA）有影响。与对照组相比，染毒剂量组黑质脑片及其培养液，纹状体脑片及其培养液DA、DOPAC和HVA浓度分别增加了36—174％、9—266％和18—546％，染毒时程组分别增加了8—260％、3—302％和41—696％。乐果对黑质脑片及其培养液，纹状体脑片及其培养液DA、DOPAC和HVA浓度有影响，并随染毒剂量和时程增加而增加，有显著性剂量效应和时程效应（p＜0.05）。 总之，通过乐果染毒大鼠，发现大脑分区和血清中单胺类神经递质DA及其代谢物DOPAC和神经递质5-HT浓度有随染毒剂量和时程的增加而增加的趋势，相反NE和E浓度有随染毒剂量和时程的增加而减少的趋势，存在剂量时程效应关系。推测乐果对单胺类神经递质的影响机制是通过抑制多巴胺-β-羟化酶活性来实现毒性效应。通过体外和体内乐果对大鼠大脑纹状体和血清DβH活性和MAO酶活性的影响试验，发现乐果对大鼠大脑纹状体和血清DβH活性有抑制效应，体外试验有剂量反应关系，体内试验有剂量效应和时程效应；乐果对大鼠大脑纹状体和血清MAO酶活性没有抑制作用，直接证明乐果对单胺类神经递质的影响机制。乐果对黑质脑片及其培养液，纹状体脑片及其培养液DA、DOPAC和HVA浓度有影响，并随染毒剂量和时程增加而增加，有显著性剂量效应和时程效应，乐果染毒脑片实验结果进一步证实乐果对单胺类神经递质的影响机制。因此，乐果对单胺类神经递质影响机制主要是通过对大鼠体内DβH活性的抑制而发挥作用的。以上结果提示乐果通过抑制DβH活性来改变体内单胺类神经递质的水平，而单胺类神经递质的异常变化与一系列精神疾病、情感障碍和运动失衡有关，有机磷农药乐果又能影响单胺类神经递质的异常变化和抑制DβH活性，因此长期接触有机磷农药可能与帕金森症、精神分裂症和阿尔采默型老年痴呆等精神和神经疾病有关，有关这方面的相互作用尚有待于进一步的深入研究。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 乐果对大鼠单胺类神经递质的影响
• 第一节 血清及脑组织中单胺类神经递质高效液相色谱电化学检测方法研究
• 1.实验部分
• 2.结果和讨论
• 3.小结
• 第二节 乐果对大鼠大脑分区单胺类神经递质的影响
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第三节 乐果对大鼠血清单胺类神经递质的影响
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第二部分 乐果对单胺类神经递质生物合成酶和代谢酶的影响
• 第一节 高效液相色谱电化学检测多巴胺-β-羟化酶活性方法研究
• 1 试剂与方法
• 2 结果与讨论
• 3 小结
• 第二节 乐果对大鼠多巴胺-β-羟化酶活性的影响
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第三节 乐果对大鼠单胺氧化酶的影响
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第三部分 乐果对新生大鼠黑质纹状体脑片多巴胺及其代谢物的影响
• 第一节 新生大鼠黑质纹状体脑片多巴胺及其代谢物的高效液相色谱电化学检测方法研究
• 1 材料与方法
• 2 结果与讨论
• 3 小结
• 第二节 乐果对新生大鼠黑质纹状体脑片多巴胺及其代谢物的影响研究
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 结语
• 参考文献
• 致谢
• 在校期间发表论文
• 综述