大白菜CMS96细胞质雄性不育的分子特性及育种应用研究

论文摘要

大白菜)Brassica campestris L．ssp．pekinensis)起源于我国，是最具中国特色、国内播种面积最大、产量最高的重要叶用蔬菜。我国大白菜资源丰富、品种类型多样，商品菜生产已经基本实现周年供应。由于大白菜具有明显的杂种优势，当前主栽品种几乎均为杂种一代。利用雄性不育系生产一代杂种已经成为大白菜育种的一种发展趋势，而细胞质雄性不育系的选育和利用是以营养器官为食用对象的大白菜等蔬菜杂种优势育种的理想途径。目前，大白菜细胞质雄性不育主要来源有3种：萝卜Ogu CMS、甘蓝型油菜Pol CMS和新型甘蓝型油菜CMS96。以往的研究主要集中在对单一大白菜细胞质雄性不育系和保持系进行比较研究，本研究从分子生物学、同工酶或蛋白质、细胞学和植物学等方面初步探索3种大白菜细胞质雄性不育（Ogu CMS、Pol CMS和CMS96）的不育特征、特性，研究大白菜细胞质雄性不育这一具有重要理论意义和经济价值的遗传现象本质，特别是探索大白菜CMS96不育系的败育机理，为更好地在大白菜育种中应用CMS96细胞质雄性不育源奠定基础。基于上述情况，本论文开展了以下五个方面的研究工作，获得的主要结论如下：1．采用RAPD和AFLP技术，对3组11份大白菜不育系、保持系的mtDNA以及nDNA进行多态性研究，RAPD和AFLP结果的聚类分析表明，大白菜CMS96和Ogu CMS不育系更为相近，遗传相似性较大。筛选了153个RAPD随机引物，其中4个RAPD引物OPB20、OP004、OPU04和OPAH16获得与大白菜Ogu CMS和CMS96不育系相关的20条RAPD片段；其中1个RAPD引物OPB06获得仅与大白菜Ogu CMS不育系相关的3条RAPD片段。将OPAH16引物在大白菜Ogu CMS、CMS96不育系扩增得到的1300bp片段和在全部材料扩增得到的900bp片段转化为SCAR标记SCAR-1300和SCAR-900；筛选了64组AFLP引物，其中3组引物E-ACC／M-CAT 500、E-ACG／M-CTG 650和E-ACT／M-CTT 370获得与大白菜CMS96不育系相关的6条AFLP片段；2组引物E-ACG／M-CAT 540和E-ACT／M-CAT 610获得与大白菜Ogu CMS不育系相关的6条AFLP片段；由5组引物获得与大白菜CMS96和Ogu CMS不育系相关的22条AFLP片段；由5组引物获得与3种大白菜不育系相关的26条AFLP片段。2．采用基于同源序列基因扩增法，利用设计的7组引物PCR扩增11份大白菜不育系和保持系mtDNA，结果表明，由atp6、orf222和orf224单一引物PCR扩增产物或atp6、orf222二组混合引物多重PCR扩增产物可以将3种大白菜不育系以及保持系区分开；综合已获得的研究结果，提出大白菜CMS96不育系的不育基因为Ogu CMS orf138和Nap CMS orf222／nad5c二组已有不育嵌合基因有机结合、重组形成的新型不育嵌合基因；推测大白菜CMS96原始不育源的获得是甘蓝型油菜Ogu CMS和Nap CMS不育系原生质体对称融合的结果。利用7组引物PCR扩增11份大白菜不育系和保持系mtDNA，获得多态性扩增结果；RT-PCR技术进一步验证片段的特异性；克隆、测序和同源性比较，研究特异片段的核苷酸和氨基酸序列特性。结果表明，7组引物在11份大白菜材料中均有扩增产物，除了atp9和coxⅠ引物外，其余5组引物扩增产物均存在差异。atp6引物扩增的200bp产物可以将大白菜Ogu CMS不育系与其它不育系、保持系区别开；orf224引物只在大白菜Pol CMS不育系中有扩增产物；atpA和orf138引物扩增产物可将大白菜Ogu CMS、CMS96不育系与其余不育系、保持系区别开；orf222引物仅在大白菜Pol CMS和CMS96不育系中有扩增产物，可以将二者与其它不育系和保持系区别开，但orf222引物扩增产物存在3点不同：前者序列长度为675bp，具有ORF224开放阅读框，没有保守结构域；后者序列长度为669bp，具有ORF222开放阅读框，与Nap CMS的orf222、nad5c核甘酸序列同源性为99％，具有YFM16保守结构域；同时，利用orf138和orf222二组引物的5种组合扩增大白菜CMS96不育系mtDNA，获得3组特异扩增产物。通过atp6和orf222二组引物混合，多重PCR扩增11份大白菜mtDNA，可以将大白菜3种不育系和保持系仅一次PCR反应完全区别开，建立了一种快速鉴定3种大白菜细胞质雄性不育系和保持系的分子技术方法：所有保持系仅扩增出1条800bp带型，可以作为保持系的区分带型；大白菜Pol CMS不育系可扩增出3条带型，其中1500bp和2300bp为其特有带型，二者不是单引物扩增的产物，而是atp6和orf222引物混合后综合扩增的产物；大白菜Ogu CMS不育系可扩增出3条带型，其中200bp为其特有带型。大白菜Ogu CMS不育系多重PCR的扩增产物与单一引物的扩增结果相同，即只有atp6引物的扩增结果；大白菜CMS96不育系可扩增出2条带型：700bp和800bp，其中700bp为其特异带型。大白菜CMS96不育系多重PCR扩增产物是单一PCR扩增产物的简单累加。3．应用水平板等电聚焦（IEF）聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，开展了2组8份大白菜不育系和保持系花、4级蕾、叶片的EST、ACP、POD同工酶和全蛋白的比较研究。结果表明，除EST外，3种大白菜不育系和保持系ACP、POD同工酶和全蛋白酶带存在差异。EST同工酶研究表明，供试材料EST酶带没有差异，均有10～11条EST酶带；POD同工酶研究表明，8份大白菜不育系和保持系花和4级蕾的POD酶带存在差异：3种不育系的C酶带活性比保持系C酶带活性强，Ogu CMS和CMS96不育系的C酶带活性又比Pol CMS不育系的C酶带活性强。所有不育系大于0.45cm蕾的C酶带活性比小于0.45cm蕾的C酶带活性强。但2组大白菜CMS96不育系的POD酶带不一致：第2组CMS96不育系B酶带活性明显比第3组CMS96不育系的B酶带活性强，也比同一组其它材料的B酶带活性强。第2组中，CMS96不育系比同一组其它材料多出1条A酶带，并与第3组材料的A酶带相同。第3组中，4种材料POD酶带数相同；ACP同工酶研究表明，大白菜Ogu CMS不育系花具有活性强的A、B酶带。大白菜Ogu CMS和CMS96不育系大于0.45cm蕾具有活性强的A、B酶带。保持系大于0.45cm蕾具有活性强的C、D酶带。所有供试材料小于0.45cm蕾的ACP酶带没有差异，均有5～6条ACP酶带；全蛋白研究表明，保持系0.35～0.55cm蕾具有活性强的A酶带，3种不育系的全蛋白酶带没有差异。4．采用透射和扫描电镜，观察大白菜CMS96不育系、保持系的花药、小孢子发育过程和表面结构。初步认为，大白菜CMS96不育系的主要败育特征为：在花粉母细胞初期，绒毡层与中层细胞提前分开，花粉母细胞虽然可以正常减数分裂，但形状不规则，花粉母细胞之间空隙大；大白菜CMS96不育系可以形成花粉，也具有花粉的纹蚀和花粉壁结构，但花粉内部营养物丧失，只有空瘪花粉粒，而且粘附在花药内，不散开。5．通过比较大白菜CMS96不育系、保持系以及试配的F1代主要植物学性状，进一步肯定了大白菜CMS96不育系和其F1代具有如下优越性：转育容易、不育度、不育株率100％、多代回交不易退化、配合力强、杂交种纯度可达100％等。获得性状优良、稳定的大白菜CMS96不育系31份；繁殖并示范推广大白菜CMS96不育系配制的4个组合：03-10、04-2、05-4和06-5；初步提出了大白菜CMS96不育系F1代良种繁育的技术规程：不育系与父本系的适宜定植比例为3比1。研究表明，大白菜CMS96不育系具有良好的育种应用前景。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语
• 目录
• 第一章 文献综述
• 1.1 十字花科雄性不育研究进展
• 1.1.1 十字花科雄性不育的来源和类型
• 1.1.1.1 十字花科雄性不育的来源
• 1.1.1.2 十字花科雄性不育的类型及遗传
• 1.1.2 十字花科雄性不育在杂种优势中的推广与应用
• 1.1.2.1 Pol CMS的应用
• 1.1.2.2 Ogu CMS的应用
• 1.1.2.3 大白菜CMS96的应用
• 1.1.2.4 细胞核雄性不育系的利用
• 1.1.3 十字花科雄性不育结构的电镜观察
• 1.1.3.1 十字花科雄性不育的超微结构
• 1.1.3.2 十字花科雄性不育的扫描结构
• 1.1.4 十字花科作物雄性不育的同工酶研究
• 1.1.4.1 过氧化物酶（POD）
• 1.1.4.2 酯酶（EST）
• 1.1.4.3 细胞色素氧化酶（COD）
• 1.1.4.4 其它种类同工酶
• 1.2 十字花科细胞质雄性不育分子生物学研究进展
• 1.2.1 线粒体基因组的概况
• 1.2.2 研究线粒体基因组所用的材料和方法
• 1.2.3 CMS不育有关的基因、嵌合基因结构
• 1.2.3.1 Ogu CMS细胞质雄性不育的研究
• 1.2.3.2 Pol CMS细胞质雄性不育的研究
• 1.2.3.3 Nap CMS细胞质雄性不育的研究
• 1.2.3.4 Kos CMS细胞质雄性不育的研究
• 1.2.3.5 Mustard CMS细胞质雄性不育的研究
• 1.2.3.6 B-tournefortii细胞质雄性不育的研究
• 1.2.4 细胞质雄性不育分子机理研究的问题及展望
• 1.3 本研究的目的和意义
• 第二章 大白菜CMS96不育系的分子特性研究
• 第一节 大白菜CMS不育系和保持系的RAPD分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.1.2.1 大白菜核DNA的提取方法
• 2.1.2.2 大白菜线粒体DNA的提取方法
• 2.1.2.3 RAPD分析、片段的克隆和SCAR转化
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 nDNA电泳检测
• 2.2.2 两种方法提取的大白菜mtDNA比较
• 2.2.2.1 两种方法提取的大白菜mtDNA凝胶电泳检测
• 2.2.2.2 改良Nunzia S方法提取的大白菜mtDNA在4种浓度琼脂糖的检测
• 2.2.3 RAPD分析
• 2.2.3.1 三种大白菜CMS不育系和保持系的RAPD分析
• 2.2.3.2 特异片段的克隆、测序和同源性比较
• 2.2.3.3 特异带的SCAR转化
• 2.2.3.4 非特异带的SCAR转化..
• 2.3 讨论
• 2.3.1 大白菜mtDNA的提取方法
• 2.3.2 大白菜mtDNA的RAPD分析
• 2.4 小结
• 第二节 大白菜CMS不育系和保持系的AFLP分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 试验方法
• 2.1.2.1 AFLP分析
• 2.1.2.2 AFLP和RAPD结果聚类分析
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 AFLP多态性结果
• 2.2.2 Pol CMS、Ogu CMS和CMS96共有的扩增产物
• 2.2.3 Ogu CMS和CMS96共有的扩增产物
• 2.2.4 Ogu CMS和CMS96各自特有的扩增产物
• 2.2.5 三种大白菜不育系的聚类分析
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 第三节 三种大白菜CMS特异序列的获得及比较分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.1.2.1 大白菜总RNA的提取
• 2.1.2.2 引物设计
• 2.1.2.3 特异引物PCR扩增
• 2.1.2.4 RT-PCR分析
• 2.1.2.5 差异带的回收、克隆和测序
• 2.1.2.6 序列分析
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 总RNA的提取和检测
• 2.2.2 七组特异引物PCR扩增产物的获得
• 2.2.2.1 cox Ⅰ特异引物PCR产物的获得
• 2.2.2.2 atp6特异引物PCR产物的获得
• 2.2.2.3 atp9特异引物PCR产物的获得
• 2.2.2.4 atpA特异引物PCR产物的获得
• 2.2.2.5 orf138特异引物PCR产物的获得
• 2.2.2.6 orf222特异引物PCR产物的获得
• 2.2.2.7 orf224特异引物PCR产物的获得
• 2.2.3 大白菜保持系和不育系的RT-PCR分析
• 2.2.3.1 atp6引物RT-PCR分析
• 2.2.3.2 atpA引物RT-PCR分析
• 2.2.3.3 orf138引物RT-PCR分析
• 2.2.3.4 orf222引物RT-PCR分析
• 2.2.3.5 orf224引物RT-PCR分析
• 2.2.4 特异片段的克隆、测序和同源性比较
• 2.2.4.1 质粒酶切检测
• 2.2.4.2 atp6引物PCR产物测序和同源性比较
• 2.2.4.3 atpA引物PCR产物测序和同源性比较
• 2.2.4.4 orf138引物PCR产物测序和同源性比较
• 2.2.4.5 orf222测序和同源性比较
• 2.2.4.6 orf224测序和同源性比较
• 2.2.5 大白菜CMS96不育的嵌合基因区域
• 2.2.6 多重PCR技术
• 2.3 讨论
• 2.3.1 基因调控与雄性不育
• 2.3.2 大白菜CMS96与Ogu CMS、Pol CMS的不同
• 2.3.3 大白菜CMS96-ORF222的性质
• 2.3.4 CMS96-ORF222的可能功能
• 2.3.5 鉴定大白菜三种不育系和保持系分子技术
• 2.4 小结
• 第三章 大白菜CMS96细胞学和生化特性的研究
• 第一节 大白菜不育系和保持系同工酶IEF电泳分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 试验材料和仪器、设备
• 3.1.1.1 试验材料
• 3.1.1.2 试验仪器、设备
• 3.1.2 试验方法
• 3.1.2.1 取材方法
• 3.1.2.2 IEF聚丙烯酰胺凝胶制备
• 3.1.2.3 IEF电泳方法
• 3.1.2.4 过氧化物酶POD的提取和染色方法
• 3.1.2.5 酸性磷酸酶ACP的提取和染色方法
• 3.1.2.6 酯酶EST的提取和染色方法
• 3.1.2.7 全蛋白的提取和染色方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 POD电泳分析
• 3.2.2 ACP电泳分析
• 3.2.3 EST电泳分析
• 3.2.4 全蛋白电泳分析
• 3.2.4.1 蛋白提取液提取全蛋白电泳分析
• 3.2.4.2 水溶液提取全蛋白电泳分析
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 第二节 大白菜保持系和CMS96不育系花药电镜观察
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.1.2.1 透射电镜样品的制备和观察
• 3.1.2.2 扫描电镜样品的制备和观察
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 透射电镜结果
• 3.2.1.1 保持系花药与小孢子发育过程
• 3.2.1.2 大白菜CMS96不育系花药与小孢子发育过程
• 3.2.2 扫描电镜结果
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 第四章 大白菜CMS96细胞质雄性不育系选育和应用
• 第一节 大白菜CMS96不育原始材料的转育
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 试验材料
• 4.1.2 试验方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 大白菜CMS96不育系的转育研究
• 4.2.2 三种CMS不育系和保持系花器官各结构的比较
• 第二节 大白菜CMS96不育系的转育研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 试验材料
• 4.1.2 试验方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 大白菜CMS96不育系和保持系的比较
• 第三节 用CMS96进行大白菜杂交一代的选育研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 试验材料
• 4.1.2 试验方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 试配CMS96不育系F1代和保持系F1代的比较
• 4.2.2 CMS96不育系新组合和保持系F1代的比较
• 4.2.3 优良大白菜雄性不育系杂交组合在生产上的应用
• 第四节 大白菜CMS96生产杂种一代的技术规范研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 试验材料
• 4.1.2 试验方法
• 4.2 结果与分析
• 4.3 本章讨论
• 4.4 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历