拉西地平对心脏成纤维细胞增殖和胶原合成的影响及其信号转导机制的研究

论文摘要

研究背景目前认为,左心室肥厚是增加原发性高血压患者病残率和病死率的一个重要的独立危险因素。心脏成纤维细胞的增殖及心肌细胞肥大是导致心肌肥厚重要的病理生理基础。高血压心肌纤维化可以引起心室功能不全、冠脉储备不良和严重的室性心律失常,使高血压患者发生心力衰竭和猝死的危险显著增加。因此,目前如何治疗高血压心肌纤维化的问题引起国内外学者的关注。拉西地平是一种新型的二氢吡啶类钙拮抗剂,它在平稳降压的同时还有效地保护靶器官,而且可显著降低高血压所致心血管事件和心血管病的死亡率,是一类具有广阔应用和发展前景的重要的降压药物。临床观察显示,拉西地平对逆转高血压左室肥厚也有一定疗效。但是,拉西地平对CFs增殖有何影响,能否调控CFs胶原合成的问题,目前尚不十分清楚。研究目的本课题观察拉西地平对血管升压素（AVP）诱导大鼠心脏成纤维细胞（CFs）增殖的影响;研究拉西地平调控AVP诱导大鼠心肌间质Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达及其蛋白表达的作用;探讨拉西地平干预对大鼠CFs的ERK1/2磷酸化的调控作用;旨在阐明拉西地平对心脏重构的作用及其可能的机制,为防治高血压提供理论依据和新的方法,同时也为拉西地平的临床应用提供一个新的途径。研究方法本研究以乳鼠CFs为研究对象,AVP诱导建立CFs增殖模型,采用MTT比色法测定细胞数目,流式细胞仪技术分析CFs周期,RT-PCR和ELISA技术测定CFs的Ⅰ、Ⅲ型胶原基因表达和细胞培养上清中的胶原蛋白含量,用蛋白免疫印迹法测定总细胞外信号调节激酶（t-ERK）1/2和磷酸化细胞外信号调节激酶（p-ERK）1/2在细胞内的表达。研究结果:（1） 10-7mol/L AVP干预24 h后,CFs的A490值（0.232±0.013）较对照组（0.132±0.008）明显增高（P<0.01）。在10-9 10 -6 mol/L拉西地平和10-7mol/L AVP共同干预下,拉西地平可呈浓度依赖性地下调CFs的A490值,分别为0.216±0.01、0.203±0.01、0.176±0.01和0.160±0.01,均显著低于AVP组（P<0.01）。10-7mol/L拉西地平单独作用组CFs的A490值（0.122±0.010）也较对照组明显降低并有统计学意义（P<0.01）。（2）细胞周期分析显示,AVP组CFs在S期的百分率和增值指数（PI）分别为13.06±0.83和21.70±1.55,与对照组（分别为4.60±0.60和8.97±1.56）比较明显增高并有统计学意义（P<0.01）。在10-7mol/L拉西地平干预下,细胞在S期的百分率（8.84±0.80）和PI （15.46±1.84）较AVP组明显降低并有统计学意义（P<0.01）。10-7mol/L的拉西地平和AVP共同作用后,细胞周期中S期的百分率（8.84±0.80）和PI（15.46±1.84）较AVP组明显降低并有统计学意义（P<0.01）,但仍高于对照组并有统计学意义（P<0.01）。10-7mol/L拉西地平单独干预组CFs在S期的百分率（4.07±0.41）和PI （6.77±0.70）与对照组比较,也明显降低并有统计学意义（P<0.01）。（3）AVP组CFs的Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达水平分别为1.42±0.06和1.03±0.04,与对照组（1.01±0.05和0.73±0.04）比较均明显地增高并有统计学意义（P <0.01）;而拉西地平可浓度依赖性下调AVP诱导CFs的Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达,其中10-7mol/L拉西地平干预组CFs的Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达水平分别为1.19±0.04和0.83±0.05,较AVP组明显降低,但仍高于对照组并有统计学意义（P<0.01）;10-7mol/L拉西地平单独作用组CFs的Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达水平分别为0.86±0.04和0.61±0.04,也较对照组明显降低并有统计学意义（P<0.01）。（4）在AVP作用的基础上,分别加入10-9 10- 6mol/L拉西地平干预后,随着拉西地平浓度的增高,Ⅰ型胶原mRNA表达水平呈递减趋势,分别为1.36±0.03、1.28±0.05、1.18±0.02和1.10±0.02;Ⅲ型胶原也呈递减趋势,分别为0.99±0.03、0.92±0.02、0.85±0.01和0.78±0.02,与AVP组Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达水平（1.44±0.06和1.07±0.03）比较均明显地降低,其中10-9mol/L拉西地平干预组与AVP组有差异（P<0.05）,10-8 10 -6mol/L拉西地平干预组与AVP组比较有显著差异（P<0.01）。（5） AVP组CFs培养上清中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白含量分别为86.40±1.44和40.37±2.92 ng/mL,与对照组（17.46±1.56和10.33±2.40ng/mL）比较明显地增高并有统计学意义（P<0.01）;给予10-9 10 -6 mol/L拉西地平干预后,随着拉西地平浓度的增高,CFs培养上清中Ⅰ型胶原蛋白含量呈递减趋势,分别为76.97±2.91、58.02±2.81、40.71±3.88和29.05±2.93 ng/mL,较AVP组明显地降低并有统计学意义（P<0.01）;Ⅲ型胶原蛋白含量也呈递减趋势,分别为35.40±2.73、25.17±3.97、18.01±0.64和15.73±2.32 ng/mL,也较AVP组明显地降低,其中10-9mol/L拉西地平干预组与AVP组有差异（P<0.05）,10-8 10 -6mol/L拉西地平干预组与AVP组比较有显著差异（P<0.01）;10-7mol/L拉西地平单独作用组CFs的Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白含量分别为9.12±1.94和4.92±0.79 ng/mL,也较对照组降低,并统计学意义（P<0.01）。（5） AVP组CFs的p-ERK1/2表达明显高于对照组,10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L拉西地平干预组心肌细胞p-ERK1/2表达与AVP组比较呈浓度依赖性降低（P<0.01）;CFs的t-ERK1/2表达在各组没有明显的差异（p>0.05）.研究结论（1）拉西地平可以浓度依赖的抑制AVP诱导CFs细胞数目的增加,降低细胞S期百分率和PI,提示拉西地平能够抑制AVP诱导CFs的增殖。（2）拉西地平以浓度依赖的方式抑制AVP诱导CFs的Ⅰ、Ⅲ型胶原基因表达和蛋白合成,提示拉西地平能够抑制AVP诱导的CFs胶原合成。（3） AVP可诱导CFs的ERK1/2的磷酸化,在以不同浓度拉西地平干预后,随着拉西地平浓度的升高,AVP诱导CFs的p-ERK1/2表达呈下降趋势;而t-ERK1/2的表达在各组中的变化不明显,提示拉西地平抑制AVP诱导的CFs增殖可能与其抑制ERK1/2的磷酸化有关。综上所述,不难看出拉西地平可以抑制CFs的增殖及胶原合成,这表明拉西地平具有逆转心肌纤维化和心肌肥厚的作用,发挥其心血管的保护作用。ERK1/2的激活在一定程度上参与了此过程。而是否还有其他信号转导通路参与其中,有待进一步研究证实。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献回顾
• 正文
• 实验材料
• 实验方法
• 实验结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 个人简历和研究成果
• 致谢