论文摘要
IL-2和IL-12基因多态性与HBV宫内感染易感性的研究研究背景与目的乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是全球性的公共卫生问题。我国是HBV感染的高发区，约30％～50％缘于母婴传播（宫内及围产期感染）。HBV宫内感染者长期处于免疫耐受，约90％慢性化，对抗病毒药物疗效差，是肝硬化、肝细胞肝癌的高危因素，因此就我国国情而言对HBV母婴传播阻断的研究显得非常重要。HBV宫内感染免疫的发生主要是在HBV感染早期机体对HBV的清除力不够，其中Th1类细胞因子对于病毒的清除有重要作用，IL-2及IL-12是Th1类细胞因子的代表，而且本课题组的前期研究已发现HBV宫内感染儿童外周血白细胞IL-2及IL-12水平降低，提示二者可能与HBV宫内感染有关。IL-12是异源二聚体细胞因子，其中p35mRNA（IL-12A）为构建性表达，p40mRNA（IL-12B）为调节性表达，故IL-12B对IL-12蛋白的表达量的影响意义更大。随着基因组医学研究的深入，遗传背景（基因多态性）对人类非遗传性疾病的发生、发展的影响日益受到重视。虽然一个基因内存在多个单核苷酸多态性（SNP）位点，但实际上对不同SNP位点进行整体研究，即由这些不同SNP构成的单倍型，更利于发现基因与疾病或某种表型的相关性。本课题的研究目的是研究IL-2基因-330位点SNP、IL-12B基因3’UTR区+1188位点SNP、G/-（G碱基缺失）多态性、启动子区4bp insert（IL-12Bpro）多态性及ATT（8/9）多态性与HBV宫内感染易感性的关系，并进行IL-12B基因多态性位点单倍型构建与分析，探讨高危儿童发生宫内HBV感染的易感因素，探讨IL-2与IL-12对我国高危儿童发生HBV宫内感染的影响的叠加或协同作用。实验对象与方法母亲为HBV携带（HBsAg和/或HBeAg阳性，或HBV DNA阳性）所生新生儿，出生后按程序进行主被动联合免疫，出生时外周静脉血HBsAg和/或HBV DNA阳性并持续6个月以上者为宫内感染组（Ⅰ组），出生时及后期随访中未出现过HBsAg和/或HBV DNA阳性，并1岁时HBsAb达保护滴度（＞10mIU/L）者为宫内未感染组（Ⅱ组），另选正常健康儿童作为正常对照。提取外周血基因组DNA，PCR扩增目的片段后进行测序或毛细管电泳法检测各组对象IL-2和IL-12B基因多态性位点的基因型。运用PHASE软件对IL-12B基因多态性位点进行单倍型构建与分析，SPSS11.5软件进行卡方检验及精确检验，检测各位点基因型、等位基因、IL-12B各单倍型在Ⅰ组、Ⅱ组和对照组间的频率分布差异及IL-2与IL-12B各位点基因型组合在Ⅰ组和Ⅱ组间的分布频率差异。结果IL-2基因及IL-12B基因多态性位点的基因型在三组对象中的分布符合Hardy-Weinberg平衡；宫内感染组与宫内感染组在性别、母亲HBV标志物及产前注射HBIG情况方面均不具有显著性差异。Ⅰ组IL-2基因-330位点AA、AC、CC基因型分布频率分别为32.4％、56.8％、10.8％，Ⅱ组为51.3％、38.2％、10.5％，正常对照组分别为54.8％，38.1％，7.1％。Ⅰ组与Ⅱ组IL-2-330三种基因型分布频率比较χ3=6.237，p=0.044；两组间AA基因型和非AA基因型（包括AC和CC）之间频率分布差异显著（p=0.019），ORAA=0.455（95％CI，0.234～0.883）；ORAC=2.132（95％CI，1.107～4.645）。三组中IL-2-330位点等位基因频率分布分别为A 64.3％、72.3％和73.8％，C 35.7％、27.7％和26.2％，Ⅰ组与Ⅱ组等位基因频率比较χ2=6.560，p=0.010；与对照组比较，频率分布差异有显著性，p=0.045；OR=0.65（95％CI，0.404～1.054）；ORC=1.53（95％CI，0.948～2.476）。Ⅰ组IL-12B基因+1188位点AA、AC、CC基因型分布频率分别为25.7％、44.3％、30.0％，Ⅱ组三种基因型分布频率为36.6％、47.9％、15.5％，正常对照组三种基因型的分布频率分别为48.8％，39.0％，12.2％。比较Ⅰ组与Ⅱ组间CC基因型和非CC基因型（包括AC和AA）之间频率分布χ2=17.078，p＜0.001，ORCC=2.338（95％CI，1.028～5.035）；三组等位基因频率分别为A 47.8％、60.7％和67.8％，C 52.2％、39.3％和32.2％，Ⅰ组与Ⅱ组等位基因频率比较χ2=4.586，p=0.032；ORA=0.597（95％CI，0.372～0.959）；C等位基因的比数比ORC=1.673（95％CI，1.043～2.684）。Ⅰ组中以4bp缺失纯合基因型（IL-12Bpro2.2，CG/CG）为主，占49.6％，而在Ⅱ组和正常对照组中则分别为29.3％和27.9％；相反，在后两组中以杂合子（IL-12Bpro1.2，CTCTAA/CG）所占比例相对较高。比较三组间三种基因型分布频率差异发现：Ⅰ组与Ⅱ组间χ2=7.223，p=0.027，差异有统计学意义；而Ⅱ组与对照组间差异无显著性（χ2=1.473，p=0.479）；Ⅰ组与Ⅱ组间IL-12Bpro2.2基因型和非IL-12Bpro2.2基因型之间频率分布差异有显著性χ2=6.286，p=0.012，OR2.2=2.346（95％CI，1.198～4.595）：OR1.2=0.450（95％CI，0.230～0.881）。Ⅰ组与Ⅱ组间等位基因频率分和差异不具有显著性χ2=3.519，p=0.061。G/-多态性及ATT（8/9）多态性的基因型及等位基因分布频率在Ⅰ组与Ⅱ组间无显著差异。+1188位点A/C多态性与4bp插入多态性进行单倍型构建后A/CTCTAA单倍型在Ⅰ组中占19.29％，明显低于Ⅱ组（31.43％），两组频率分布具有显著性差异（p=0.028），ORA/CTCTAA=0.521（95％CI，0.300～0.904）；IL-12B四个位点组成的单倍型“-/A/CTCTAA/ATT。”在两组间频率分布差异无统计学意义（p=0.065），但在宫内感染组占15.11％，明显低于宫内未感染组（24.24％）；其它单倍型组间频率分布均无显著差异（p＞0.10）。G/-多态性与+1188位点C/G单倍型和A/-单倍型频率显著高于A/G和C/-单倍型（＜10％），但两组间的各单倍型频率分布并没有显著差异。IL-2基因-330位点与IL-12B+1188位点AA/AA基因型组合在Ⅰ组占4.92％，而在Ⅱ组则占20.63％，两组间频率分布差异具有显著性（p=0.015），OR=0.198；而AC/CC基因型组合在两组中的比例分别为21.31％和4.72％，差异具有显著性（p=0.007），OR=5.417。IL-2基因-330位点与IL-12B基因G/-多态性AA/（-/-）基因型组合在两组中的比例分别为4.69％、17.65％，两组间频率分布差异具有显著性（p=0.026），OR=0.229；而AC/GG组合在两组中的比例分别为18.75％和2.94％，差异具有显著性（p=0.004），OR=7.647。IL-2基因-330位点与IL-12Bpro多态性的AA/（CTCTAA/CTCTAA）的基因型组合在两组中的比例分别为1.56％和13.24％，两组间频率分布差异具有显著性p=0.018，OR=0.104；而AC/（CG/CG）基因型组合在两组中的比例分别为26.56％和11.76％，差异具有显著性（p=0.030），OR=2.738。其他基因型组合在两组的分布则无显著差别。结论IL-2-330（A/C）位点SNP与HBV宫内感染易感性有关。其中A等位基因及AA基因型在Ⅱ组明显占优势，提示A等位基因及AA基因型对携带HBV母亲所生的高危儿童发生HBV宫内感染有一定的保护作用，而携带AC基因型的高危儿童则容易发生HBV宫内感染。IL-12B+1188位点A/C多态性和IL12Bpro多态性与HBV宫内感染易感性有关：+1188位点CC基因型及C等位基因携带高危儿童易发生HBV宫内感染，而A等位基因对携带HBV母亲所生的高危儿章发生HBV宫内感染有一定的保护作用；IL12Bpro2.2基因型（CG/CG）是高危儿章发生HBV宫内感染的易感基因型，IL12Bpro1.2基因型（CTCTAA/CG）对高危儿童发生HBV宫内感染有一定保护作用。IL-12B基因G/-及ATT（8/9）多态性位点与HBV宫内感染易感性无关。IL-12B基因+1188（A/C）位点多态性及IL12Bpro多态性组成的单倍型与HBV宫内感染易感性有关，其中A/CTCTAA单倍型对HBV宫内感染具有一定的保护作用，其他位点的单倍型则未出现单倍型效应。IL-2基因与IL-12B基因对于HBV宫内感染易感性的影响有协同作用。
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