论文摘要
背景和目的:卒中是导致人类死亡的三大疾病之一,也是中老年致残的主要原因,其中缺血性卒中病占75-80%。且随着世界人口老龄化进程的加快,其威胁及危害将会越来越严重。目前尚缺乏一种针对性强的神经元保护药物。因此,对本病病理机制和防治措施的研究受到高度重视。目前研究多致力于卒中后脑保护剂的开发,但是除了大剂量白蛋白和低温脑保护这两种非特异性的方法,其它均只对动物模型有效,其主要原因就是脑保护机制不明和找不到合适的药物作用靶点。目前对于缺血半暗带区处于凋亡状态的神经元命运的逆转,成为脑保护剂作用的最终思路。近年来研究发现,线粒体在整合各种死亡信号刺激、决定细胞命运的过程中起着枢纽的作用。因此通过多种机制保护线粒体为缺血性脑血管病治疗提供新的思路。在脑缺血时线粒体蛋白自身表达的差异可能是线粒体在凋亡过程中起决定作用的物质基础,研究这些差异蛋白,可以作为选择药物作用的靶点,对缺血性神经元损伤的防治有着重要意义。3-正丁基苯酞（3-n-butylphthalide,简称NBP）是一种能阻断脑缺血病理过程的多个环节的线粒体保护药物,但是其药物作用的靶点并不清楚。差异蛋白质组学为在全貌分析蛋白质组表达差异的基础上探索细胞分子机制提供了可能。双向凝胶电泳和基质辅助飞行时间质谱是差异蛋白质组学常用的支柱性技术。在功能相关分子、标志物和药物靶位筛选研究中的应用显示了此二种技术的价值。本研究应用蛋白质组学技术分析了正常与脑缺血大鼠脑皮质线粒体蛋白从急性期到慢性期的动态表达变化,并对差异蛋白质加以鉴定,以期探寻脑缺血后疾病发生的病理生理机制,为进一步筛选特异性功能相关蛋白和干预靶位提供线索。同时观察大鼠皮层神经元超微结构及脑组织线粒体呼吸链功能在局灶性脑缺血前后的动态变化。在此基础上我们在脑缺血急性期给予线粒体保护剂NBP药物进行干预,通过蛋白质组学技术方法探索NBP药物作用的靶点。方法:健康成年SD大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组、NBP药物治疗组,除NBP药物治疗组选取6 h时间段外,余各组又分为6 h、24 h、48 h、72 h四个时间段。动物模型参照Longa线栓法并加以改进,NBP药物治疗组采用缺血15 min后腹腔内注射给药。各组大鼠在规定时间快速断头取脑,分离大鼠缺血及正常大脑皮层,纯化线粒体蛋白进行二维电泳和凝胶图像分析,对差异蛋白质用HPLC-Chip/MS纳流液质联用技术进行序列分析,经Spectrum Mill搜索NCBInr数据库后鉴定蛋白质。同时透射电镜观察缺血后脑组织神经元超微结构的改变;检测呼吸链ST3、ST4、RCR、OPR等评价呼吸功能的指标。结果:1、采用优化的双向电泳技术条件建立了高质量的、稳定的、高重复性的大鼠脑皮质线粒体蛋白质组双向电泳图谱,为进一步开展疾病状态下大脑皮层线粒体蛋白质组学研究奠定了基础。2、正常与脑缺血大鼠脑皮层线粒体蛋白表达存在显著差异,这些差异蛋白经鉴定,主要为TUC-4b、肌酸激酶同工酶、HS1结合蛋白、线粒体核糖体蛋白S27、异柠檬酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶、二氢硫辛酸脱氢酶、泛醌-细胞色素C还原酶、琥珀酸辅酶A还原酶、细胞色素氧化酶、F1-ATP beta链、热休克蛋白70、热休克蛋白60、脂酰辅酶A脱氢酶等差异线粒体蛋白。HS1结合蛋白在MCAo 6h时表达量明显降低,24 h达到最低点,72 h恢复至接近正常水平。余蛋白均在MCAo 6h表达量明显增高,24 h达到最高峰,72 h恢复接近正常水平。3、局灶性脑缺血大鼠脑组织神经元在6 h时结构严重破坏,24 h达到高峰,72 h恢复接近正常水平;与对照组相比较,脑缺血6 h组、24 h组、48 h组、72 h组ST3、RCR、OPR均降低,ST4升高。ST3在脑缺血6 h、24 h、48 h、72 h时均降低（P<0.01）,各时相点比较发现缺血24 h时ST3降至最低,48 h开始恢复,至72 h时未恢复至正常水平。RCR在6 h、24 h显著降低降低（P<0.01）,72 h降低,其变化趋势同ST3。OPR在24 h、48 h降低（P<0.01）,72 h亦降低（P<0.05）,变化趋势同ST3。ST4在各时向点均升高,只在6 h、72 h有差异（P<0.05）。4、脑缺血大鼠经NBP药物治疗后6 h皮层线粒体蛋白表达发生了显著的变化,这些差异蛋白经鉴定与脑缺血时剧烈变化的蛋白完全吻合。HS1结合蛋白在脑缺血6 h时表达量明显降低,经NBP药物治疗后在6 h时增高接近于正常水平。余蛋白均在脑缺血6 h时表达量明显增高,经NBP药物治疗后6 h时均降低接近正常水平。结论:1、脑缺血可以导致皮层线粒体相关蛋白表达改变,提示其作用可能与线粒体能量代谢、凋亡有关。2、脑缺血急性期线粒体结构破坏,功能受损严重,随着时间延长均有所恢复;其变化趋势与蛋白表达变化相一致。保护线粒体呼吸链可能对脑缺血损伤有保护作用。3、NBP药物对脑缺血后线粒体有保护作用,其作用靶点可能与差异表达蛋白相关。