刚竹属部分竹种遗传多样性的ISSR分析

论文摘要

竹类植物是地球陆地生态系统的重要组成部分,生长快,用途广。不仅具有重要的经济价值,而且具有良好的水源涵养和水土保持功能。刚竹属是竹亚科中种类最多的属,多达50余种。该属的几乎所有竹种均原产于我国,其中一些观赏价值较高的竹种已被广泛应用于园林造景和城乡绿化。因此,刚竹属植物研究备受重视。DNA分子标记是一种新的遗传标记,它是基因型的特殊的易于识别的表现形式,是生物分类学、育种学、遗传学和物种起源与进化等研究的主要技术指标之一。分子标记直接揭示DNA水平的差异,用它来描述植物的遗传多样性更为直观、准确。简单重复间序列标记（Inter-Simple Sequence Repeat,ISSR）是一种理想的基于PCR技术的分子标记。目前在植物种质资源鉴定、构建遗传图谱、基因定位、遗传多样性及分子生态学研究中得到广泛应用。本文利用ISSR技术,对刚竹属（Phyllostachys）的14个常见观赏竹种,即金竹的3个变型竹种:绿皮黄筋竹（P.sulpurea cv.houzeau）、黄皮绿筋竹（P.sulphurea cv.robert）、刚竹（P.sulphurea cv.viridis）;龟甲竹（P.heterocy）和3个变型竹种:毛竹（P.heterocyclacv.pubescens）、花毛竹（P.heterocycla cv.tao）、黄槽毛竹（P.heterocycla cv.luteosulcata）;紫竹（P.nigra）及其变种毛金竹（P.nigra var.henonis）;斑竹（P.bambusoides f.lacrimadeae）;早竹（P.praecox）;黄槽竹（P.aureosulcata）及其栽培型竹种金镶玉竹（P.aureosulcata f.spectabilis）;黄竿乌哺鸡竹（P.vivax f.aureocaulis）进行基因组多样性分析。通过研究刚竹属植物基因组提纯方法,优化ISSR-PCR反应体系,根据UPGMA方法构建聚类树状图进行聚类分析,试验结果如下:1、以黄皮绿筋竹作为研究对象,比较SDS法和CTAB法,发现CTAB法较适合竹子基因组的提纯;并通过改良CTAB法,建立适合刚竹属植物基因组提纯的方法。2、采用L16（45）正交试验设计,对Taq酶、dNTP、Mg2+浓度、引物及模板DNA浓度进行优化筛选,建立了刚竹属植物ISSR-PCR反应的最佳体系,即20μL反应体系中含有1×buffer、Taq酶1.5 U、Mg2+2.5 mmol/L、模板DNA 80 ng、dNTP0.15 mmol/L、引物0.4μmol/L;通过梯度PCR试验筛选得到相应引物的最佳退火温度。3、利用ISSR技术对14个观赏竹种进行基因组DNA多样性分析,从40条ISSR引物中筛选出10条进行PCR扩增。共扩增出75条重复性高、清晰的条带,多态性条带60条,多态性位点百分率为80%。扩增片段长度大多数集中在0.3～2.0 kb之间。4、利用扩增的片段进行14个竹种的遗传差异分析,根据UPGMA方法构建聚类树状图:（1）同属于金竹变型种的刚竹与绿皮黄筋竹、黄皮绿筋竹没有聚为一类,说明它们之间的遗传距离较远、遗传变异程度大;（2）黄秆乌哺鸡竹和斑竹聚为一类,说明它们之间的遗传距离相对较近;（3）其它竹种间的聚类关系较符合传统竹子分类系统。其中早竹,金镶玉竹和黄槽竹,紫竹和毛金竹,毛竹、花毛竹、龟甲竹和黄槽毛竹都单独聚为一类;（4）其中花毛竹和黄槽毛竹间的遗传距离最近为0.0134,早竹和毛竹间的遗传距离最远为0.7621。说明用ISSR技术对刚竹属植物分类和亲缘关系研究是非常有效的。综上所述,建立了刚竹属植物基因组DNA提纯的方法,优化了ISSR-PCR反应体系,开展刚竹属部分观赏竹种ISSR分子标记的研究。试验结果为观赏竹的遗传育种、品种改良乃至竹类植物的分类系统研究奠定理论基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 分子标记技术
• 1.1.1 RFLP技术
• 1.1.2 AFLP技术
• 1.1.3 RAPD技术
• 1.1.4 SSR和ISSR
• 1.1.5 SNP
• 1.2 DNA分子标记在竹子中的应用
• 1.2.1 种质资源鉴定
• 1.2.2 种属遗传多样性与亲缘关系鉴定
• 1.2.3 竹子分类上的应用
• 1.2.4 构建指纹图谱
• 1.3 竹子研究的应用前景
• 1.3.1 遗传多样性研究
• 1.3.2 ISSR技术的应用
• 1.3.3 竹子其它方面研究前景
• 2 引言
• 2.1 本课题的研究意义
• 2.2 本研究的内容、目标
• 2.2.1 研究内容
• 2.2.2 研究目标
• 2.3 本研究采用的技术路线
• 3 材料和方法
• 3.1 试验材料
• 3.1.1 植物材料
• 3.2 主要仪器设备和试剂
• 3.2.1 主要仪器设备
• 3.2.2 主要试剂
• 3.2.3 主要试剂的配制
• 3.3 试验方法
• 3.3.1 竹子DNA的提取
• 3.3.2 DNA质量检测
• 3.3.3 PCR正交试验设计与分析
• 3.3.4 ISSR引物筛选
• 3.3.5 竹子品种遗传多样性的数据分析
• 4 结果与分析
• 4.1 竹子基因组DNA质量分析
• 4.1.1 竹子DNA电泳检测
• 4.1.2 竹子DNA浓度检测
• 4.2 正交优化体系分析
• 4.2.1 Taq酶浓度对PCR结果的影响
• 2+浓度对PCR结果的影响'>4.2.2 Mg²⁺浓度对PCR结果的影响
• 4.2.3 dNTP浓度对PCR结果的影响
• 4.2.4 引物浓度对PCR结果的影响
• 4.2.5 模板DNA浓度对PCR反应的影响
• 4.2.6 优化的反应条件和反应体系
• 4.2.7 最佳退火温度的确立
• 4.3 ISSR-PCR结果分析
• 4.3.1 ISSR-PCR扩增结果
• 4.3.2 聚类分析
• 5 讨论与结论
• 5.1 讨论
• 5.1.1 刚竹属植物DNA的提取
• 5.1.2 刚竹属种质资源的遗传多样性
• 5.1.3 ISSR技术及其反应体系的优化
• 5.1.4 ISSR技术在竹子中的应用
• 5.1.5 竹类植物在现代园林中的应用
• 5.1.6 展望
• 5.2 结论
• 参考文献
• 附图
• 附录
• 致谢
• 个人简介
• 在读期间发表的论文