极地海洋沉积放线菌分离培养与筛选

论文摘要

海洋沉积物是营养较为丰富的微生物栖息地,蕴涵着丰富独特的海洋微生物资源,特别是以能产生多样的次级代谢产物而著称的放线菌。研究海洋沉积放线菌,不但可以发现新的放线菌资源,同时也可以发现新型活性产物,如抗病毒、抗肿瘤的新抗生素、海洋生物毒素、酶类、抗心血管病化合物、酶类抑制剂、生物功能材料等在医药、食品、化工、环保及其它各行业上具有重要价值的活性物质。本研究对两极地区8份海洋沉积物进行放线菌的分离培养,通过16S rDNA对分离菌株进行鉴定,并对分离鉴定得到的放线菌株进行生态条件的研究和次生代谢基因及抗菌活性的筛选。通过稀释平板法和ARDRA及16S rDNA序列测定技术,从极地海洋8份沉积样品中共分离到22个ARDRA分型的85株放线菌,分别属于赖氏菌属（Leifsonia）、盐细菌属（Salinibacterium）、节杆菌属（Arthrobacter）、红球菌属（Rhodococcus）、气微菌属（Aeromicrobium）和冰冻小杆菌属（Frigoribacterium）等6个属。其中来自南极普里兹湾潮间带的ZS314与最近菌株序列相似度低于97%,可能为微杆菌科（Microbacteriaceae）冰冻小杆菌属（Frigoribacterium）属的一个新种。各沉积物中放线菌多样性有所不同,其中从南极海洋沉积物中分离到的放线菌以赖氏菌和红球菌为主,而北极海洋沉积放线菌中赖氏菌和盐细菌比较多。而各沉积物中放线菌分离情况也有很大差别,分离自南极中山站海区潮间带样品ZS3的放线菌株,无论是在数量还是多样性上,都是最多的,共分离到4个属的38株放线菌,其放线菌分离率高达63.33%,而从北极新奥尔松地区的沉积样品KS6中放线菌分离情况最差,只分离到2株放线菌,放线菌分离率只有20%。采用不同培养基对沉积物进行放线菌分离培养的研究中发现,ISP3培养基、ISP5培养基和无机盐琼脂培养基,分离培养获得的菌落数目、种类都较多,经鉴定后获得的放线菌株数量也较多,放线菌分离率比较高（均大于60%）,是较为理想的海洋沉积放线菌培养基。所有测试放线菌株在海水培养基中的生长情况均优于去离子水培养基,最大耐盐度达10%。其中盐细菌属的S303、S304、S318、S326、S331在不添加NaCl的培养基中无法生长,表现出对盐的需求,是严格意义上的海洋放线菌。所有测试菌株在0℃均能生长,其中大多数最适生长温度在1525℃之间,为耐冷菌。最适pH在7-8之间,在pH4下均不生长,多数在pH10下可以生长,为耐碱性菌株。对放线菌株进行I型、II型PKS（多聚酮合酶）基因和NRPS（非核糖体肽合成酶）基因进行扩增,共筛选到72株具有PKS和/或NRPS基因的菌株。其中具有I型PKS基因的放线菌株有11株,具有II型PKS基因的菌株有24株,具有NRPS基因的菌株有68株。有25株阳性菌株同时含有两种基因,而从3株红球菌ZS350、ZS352、ZS360中能扩增得到全部三种基因,这些菌株极有可能能产生具有价值的代谢产物。以枯草芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌为指示菌对放线菌株进行抗菌活性筛选,结果未筛选到活性菌株,有必要优化实验方法和条件对其活性进行进一步研究。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 1. 对极地海洋沉积放线菌研究的意义
• 2. 海洋放线菌的研究概况
• 3. 放线菌研究方法与研究现状
• 3.1 海洋放线菌的分离培养
• 3.2 放线菌的分类及鉴定
• 3.3 海洋放线菌的生物活性物质
• 4. 论文的设计思路
• 第一章 极地海洋放线菌的分离培养及鉴定
• 1. 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 2. 结果
• 2.1 菌株的分离
• 2.2 DNA 的抽提及16S rDNA 的扩增
• 2.3 16S rDNA 产物的ARDRA 分析
• 2.4 代表菌株的序列测定及放线菌的系统发育分析
• 3. 讨论
• 3.1 放线菌株的16S rDNA 序列系统发育分析
• 3.2 极地海洋沉积放线菌的分布及多样性
• 3.3 放线菌的分离方法
• 3.4 菌株ZS314 的初步鉴定
• 3.5 两种放线菌DNA 抽提方法的比较
• 第二章 极地海洋沉积放线菌生态条件的研究
• 1. 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 2. 结果
• 2.1 代表菌株的形态特征
• 2.2 放线菌株的生态条件
• 3. 讨论
• 3.1 需海水及嗜（耐）盐性
• 3.2 放线菌株的生长温度
• 3.3 其他
• 第三章 极地海洋沉积放线菌I 型、II 型PKS 基因和NRPS 基因的初步筛选及抗菌活性的检测
• 1. 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 2. 结果
• 2.1 PKS I 型、II 型和NRPS 基因的筛选
• 2.2 放线菌株的抗菌活性检测
• 3. 讨论
• 3.1 PKS、NRPS 基因的筛选
• 3.2 抗菌活性筛选
• 第四章 总结
• 1. 主要结论
• 1.1 极地海洋沉积放线菌的分离培养及鉴定
• 1.2 极地海洋沉积放线菌生态条件的研究
• 1.3 极地海洋沉积放线菌I 型 I、I 型PKS 基因和NRPS 基因的初步筛选研究
• 2. 研究展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果