狂犬病野毒株全基因组序列分析及分子进化研究

论文摘要

狂犬病广泛流行于世界各地，狂犬病毒具有多种动物宿主，欧美的狂犬病主要以野生动物为主，亚洲和非洲的狂犬病以家养动物为主。目前狂犬病毒可分为7个基因型，还有几株新分离的病毒尚需确立分类地位。中国自2000年以来狂犬病的流行呈逐年上升的趋势，由于中国尚未开展大面积普遍的狂犬病流行病学调查，所以对中国境内狂犬病的流行情况还不明确，为了有效防制狂犬病，非常有必要对自然界分离的狂犬病街毒进行分子流行病学研究，以了解不同地域不同宿主病毒的流行特点。本研究所用的两个毒株，DRV分离自吉林某鹿场患狂犬病的梅花鹿，MRV分离自河南某地狂犬病疫区野鼠体内。两个毒株具有不同的地域分布和不同的宿主特点，具有代表性。对于狂犬病野毒株的全基因组序列测定和分析在我国尚属首次。本研究主要采取RT-PCR产物克隆的方法进行毒株全基因组扩增克隆和测序，病毒基因组末端测序采取3’-RACE和5’-RACE方法。根据已测定的狂犬病毒株全基因组序列，用分子生物学软件设计了用于3’-RACE的接头引物一对，用于5’-RACE的2对嵌套引物、1条5’磷酸化引物，用于普通PCR的8对引物，这些引物扩增序列覆盖了整个病毒全基因组序列，具有一定的重叠区域。PCR产物纯化回收后直接与T载体连接转化克隆，鉴定的阳性克隆菌株送生物公司测序，阳性克隆菌种加甘油冷冻保存。PCR产物克隆测序结果经NCBI在线BLAST搜索验证后，用分子生物学软件进行序列的拼接和注释，得到了两株狂犬病野毒株的全基因组序列，其中DRV株全基因组序列长11863bp，MRV株全基因组序列长11869bp。在测定的全基因组cDNA序列上，每个毒株都由5个基因组成，每个基因编码区的起始密码子都为“ATG”，终止密码子为“TAA”或“TGA”，各基因转录信号位点准确，与其他已测定的基因1型狂犬病毒株比较各个基因的编码长度没有改变，说明本实验所测定的两个毒株基因编码区没有发生插入和缺失的变异发生。应用生物信息学的理论和方法，利用各种基因信息资源和基因数据库（NCBI、EMBL等），以测定的两个狂犬病毒野毒株全基因组核苷酸序列为基础，运用多种分子生物学软件对两个狂犬病毒野毒株的基因组结构进行全面的分析与比较，并对组成狂犬病毒基因组的5个基因分别进行了多重序列同源性分析和比对，得到了5个基因的分子进化树。分析比较结果显示，本研究所测定的两个毒株在非编码区有多种变异形式发生，包括核苷酸的替换、插入、缺失，但是非编码区转录起始和终止信号“UUGU”、“UUUUUUU”没有变异，在非编码区有一些序列存在着高度的保守性，估计与基因的转录直接相关。在编码区没有插入和缺失的变异发生，主要是核苷酸的替代，对主要功能位点的比较发现，两个毒株在N基因、G基因的主要抗原部位都有氨基酸的突变发生，这些突变将直接影响到病毒毒力的变化和免疫原性。对各个基因5’端非编码区RNA二级结构预测结果显示，两个毒株的基因5’端非编码区尽管有核苷酸序列的变异，但是二级结构相似，而且各个基因的5’端非编码区具有类似的结构。对5个基因的蛋白质二级结构进行了预测和分析，在疏水结构和亲水结构方面，两个毒株没有明显的变异发生。根据GenBank或相关论文的资料，选取有代表性和背景资料确定的毒株序列，分别对5个基因进行多重序列同源性分析和比对，DRV和MRV之间N、NS、M、G、L基因的同源性分别为91％、91％、95％、91％、91.3％；与DRV同源性最高的分别是：3aG为94％（N）、Nishigahara为95％（NS）、RH-CL为98％（M）、3aG为95％（G）、Ni-CE为98％（L）；与MRV同源性最高的分别是：CVS为99％（N）、AV01为98％（NS）、CVS为99％（M）、CVS-N2C为98％（G）、PM1503为99.2％（L）。对狂犬病毒基因组5个基因的分子进化树分析表明，为了逃避宿主的免疫压力，G基因的进化最快速，而且具有宿主的特异性，在G基因的进化中，DRV和MRV分别位于不同的组群，DRV与中国人用疫苗株和日本疫苗株在一个组群，MRV与CVS以及犬脑分离的街毒归在一个组群，结合其他基因的进化树表明，DRV与疫苗株具有较近的亲缘关系，从分子水平验证了以前对DRV流行病学调查得出的推测，在狂犬病疫情发生的鹿场附近曾使用过人用狂犬病疫苗，导致梅花鹿感染狂犬病毒。MRV的各个基因进化树表明，其与野毒株具有较近的亲缘关系，通过L基因的进化树分析，两个毒株的进化时间较短，其他基因进化树分析表明，MRV与亚洲和中国流行的野毒株具有较近的亲缘关系，所以推测MRV应该是中国固有的野毒株，由于某种原因感染野鼠后病毒进化变异而产生的毒株。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 狂犬病流行概况
• 1.2 狂犬病毒分类
• 1.3 狂犬病毒的分子生物学特点
• 1.4 狂犬病毒分子流行病学研究进展
• 1.5 狂犬病的防制
• 1.6 本研究的目的与意义
• 第二章 狂犬病野毒株DRV、MRV全基因组序列测定
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 狂犬病毒核酸RT-PCR检测
• 2.3.2 反向PCR方法扩增基因组3’末端
• 2.3.3 基因组5’末端扩增基因片段
• 2.3.4 普通PCR方法扩增基因组5’末端和3’末端中间各基因片段
• 2.3.5 狂犬病毒核酸RT-PCR检测产物测序结果
• 2.3.6 DRV、MRV两个毒株全基因组序列拼接结果
• 2.4 讨论
• 2.4.1 关于狂犬病毒RT-PCR检测方法
• 2.4.2 关于引物设计
• 2.4.3 关于末端测序
• 2.4.4 如何保证所测定序列的准确性
• 2.4.5 关于DRV和MRV株全基因组序列
• 2.4.6 本研究结果的应用前景
• 2.5 小结
• 第三章 狂犬病野毒株DRV、MRV全基因组序列分析比较
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 全基因组组成及各基因长度比较
• 3.3.2 先导RNA序列碱基组成特点
• 3.3.3 基因间隔序列分析比较
• 3.3.4 基因非编码区碱基组成特点及变异分析
• 3.3.5 基因编码区核苷酸序列分析
• 3.3.6 基因编码氨基酸序列分析
• 3.4 讨论
• 3.4.1 狂犬病毒基因组结构变异特点
• 3.4.2 基因组间隔序列变异特点
• 3.4.3 基因3’端非编码区序列变异特点
• 3.4.4 基因5’端非编码区序列变异特点
• 3.4.5 基因主要功能位点的变异
• 3.5 小结
• 第四章 狂犬病野毒株DRV、MRV全基因组分子进化研究
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 N基因的分子进化研究
• 4.3.2 NS基因的分子进化研究
• 4.3.3 M基因的分子进化研究
• 4.3.4 G基因的分子进化研究
• 4.3.5 L基因的分子进化研究
• 4.3.6 G-L基因间隔的分子进化研究
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 第五章 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 个人简介