姜黄素抗人肺腺癌A549/DDP细胞增殖及诱导凋亡的作用研究

论文摘要

目的与意义:肺癌是我国乃至世界发病率最高的恶性肿瘤,已成为人类癌症主要死亡原因之一。随着以铂类为一线药物的方案在晚期非小细胞肺癌化疗中的广泛应用,肺癌对铂类的耐药已成为目前关注的热点。大多数化疗药物,无论单独还是联合,对晚期非小细胞肺癌疗效均不佳,且毒副反应大。因此,寻求新的化疗药物和逆转耐药药物深受临床肿瘤学家和药物学家的关注。从植物中开发抗肿瘤药物,是国内外抗肿瘤新药开发的一个热点。现代医学研究发现姜黄素（curcumin, cur）具有较强的抗肿瘤生物活性,体内外实验研究均表明姜黄素对多种肿瘤都具有明显的抑制细胞生长,诱导细胞凋亡作用。但是关于姜黄素对耐药人肺腺癌细胞A549/DDP的作用尚少见报道。本研究以人肺腺癌A549/DDP细胞株为受试对象,研究姜黄素对人肺腺癌A549/DDP细胞增殖的抑制作用及其对细胞凋亡的影响,旨在进一步阐明姜黄素的抗肿瘤机制,为其应用于肿瘤的临床治疗提供更多的实验依据。方法:①采用细胞计数法绘制亲代A549和A549/DDP细胞生长曲线,四甲基偶氮唑蓝（MTT）法测定A549/DDP对顺铂的耐药指数。②采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法测定姜黄素对A549和A549/DDP细胞的增殖抑制作用,计算出姜黄素对两细胞系的半数抑制浓度,比较有无差异;并用接近半数抑制浓度的姜黄素处理细胞24 h,经PI荧光染料染色后,用流式细胞仪分析细胞周期。③用0、5、l0、20、30、40μmol/L姜黄素处理A549/DDP细胞24h后,在荧光显微镜下观察细胞形态学的变化;应用原位末端标记（TUNEL）染色及流式细胞仪检测细胞凋亡情况。④用0、5、l0、20、30、40μmol/L姜黄素处理A549/DDP细胞24h后,提取各组细胞总蛋白并以western-blot分析凋亡相关蛋白caspase-8p10的表达变化。结果:①亲代A549细胞和A549/DDP细胞的生长曲线相似,倍增时间分别为（33.24±0.24）h和（32.88±0.11）h （P>0.05）; DDP处理A549和A549/DDP细胞72h后,半数抑制浓度（IC50）分别为13.57μmol/L和146.79μmol/L,A549/DDP细胞对顺铂的耐药指数为10.82。②姜黄素对A549及A549/DDP细胞增殖均有抑制作用,并且呈时间、浓度依赖性（P<0.05）;姜黄素作用48h后对两细胞株的半数抑制浓度即IC50值分别为16.28μmol/L和18.06μmol/L,差异无统计学意义（P>0.05）。③20μmol/L的姜黄素作用A549/DDP细胞24h后,实验组G2/M期细胞比例（31.5±2.0）%显著高于对照组（17.3±1.3）%,S期细胞比例（19.6±1.0）%显著低于对照组（35. 5±2.4）%,差异有统计学意义（P<0.05）。G0/G1期细胞比例分别为（47.5±0.9）%和（48.8±0.9）%,差异无统计学意义（P>0.05）。④姜黄素处理A549/DDP细胞后,Hoechst染色显示A549/DDP细胞核缩小变形,致密浓染,荧光成团块分布。⑤0、5、l0、20、30、40μmol/L的姜黄素作用于A549/DDP细胞24 h后,原位末端标记（TUNEL）结果显示,凋亡指数分别是（2.6±0.5） %、（10.7±2.3） %、（20.5±3.1） %、（28.6±3.4） %、（35.7±0.4） %、（49.5±4.4） %,显示出明显的剂量依赖关系（P<0.05）。⑥早期凋亡细胞即An+PI-细胞所占的百分比分别为2.93%、3.68%、7.71%、20.23%、23.0%、32.15%,显示出明显的剂量依赖关系（P<0.05）。⑦western-blot结果显示,随姜黄素浓度的增加,caspase-8 p10蛋白水平增加。结论:①耐药A549/DDP细胞基本保留了亲代细胞的生长特性,相对于其亲本细胞系A549,确实对传统化疗药物顺铂产生明显的耐药性。②姜黄素对A549及A549/DDP均有生长抑制作用,并呈剂量、时间依赖性, A549/DDP对姜黄素不具有耐药性。③姜黄素可引发A549/DDP细胞周期阻滞于G2/M期。④姜黄素能诱导A549/DDP细胞凋亡,caspase-8的活化是其中的机制之一。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 文献回顾
• 正文
• 第一部分：A549/DDP细胞耐药性的鉴定
• 1 材料
• 1.1 主要仪器
• 1.2 普通耗材
• 1.3 主要试剂
• 1.4 常用缓冲液及培养基
• 1.5 细胞系
• 2 方法
• 2.1 细胞培养与传代
• 2.2 A549 和A549/DDP细胞生长曲线的测定
• 2.3 顺铂对亲代A549 细胞和A549/DDP细胞的剂量效应
• 2.4 统计学处理
• 3 结果
• 3.1 亲代A549 细胞和A549/DDP细胞生长特性比较
• 3.2 A549/DDP细胞耐药性的鉴定
• 4 讨论
• 第二部分：姜黄素对A549 和A549/DDP细胞增殖及细胞周期的影响
• 1 材料
• 1.1 主要仪器
• 1.2 普通耗材
• 1.3 主要试剂
• 1.4 常用缓冲液及培养基
• 1.5 细胞系
• 2 方法
• 2.1 姜黄素对A549 及A549/DDP细胞增殖的影响
• 2.2 姜黄素对A549/DDP细胞周期的影响
• 2.3 统计学处理
• 3 结果
• 3.1 姜黄素对A549 及A549/DDP细胞增殖的影响
• 3.2 姜黄素对A549/DDP细胞周期的阻滞
• 4 讨论
• 第三部分：姜黄素诱导A549/DDP细胞凋亡及其机制的研究
• 1 材料
• 1.1 主要仪器
• 1.2 普通耗材
• 1.3 主要试剂
• 1.4 常用缓冲液及培养基
• 1.5 细胞系
• 2 方法
• 2.1 A549/DDP细胞凋亡的检测
• 2.2 姜黄素对A549/DDP细胞caspase-8 的影响
• 2.3 统计学处理
• 3 结果
• 3.1 A549/DDP细胞凋亡的检测
• 3.2 Western blot 的结果
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 附录
• 个人简历和研究成果
• 致谢