红色红曲菌聚酮合酶基因Mrpks10克隆与功能初步研究

论文摘要

聚酮合酶（Polyketide synthease, PKS）在红曲菌（Monascus spp.）的代谢中可催化产生大量的聚酮化合物（Polyketide）,主要包括红曲色素、Monaclin K和桔霉素。目前NCBI上已经提交了红曲菌的Monaclin K和桔霉素的生物合成基因簇,而控制红曲色素合成的pks基因的克隆还未见报道。通过克隆红曲菌中潜藏的pks基因,为红曲菌聚酮合成途径的进一步研究奠定基础。本研究通过简并PCR的方法从红色红曲菌（Monascus ruber） M-7中克隆得到了一个pks基因片段,将其命名为Mrpksl0,并通过基因敲除技术对其功能进行了初步研究,主要实验内容如下：1.Mrpks10基因的克隆及序列分析根据与红曲菌亲缘关系较近物种的pks的KS功能域DNA序列和氨基酸序列的保守序列,设计了一对简并引物,克隆得到了约700bp的Mrpks10基因片段,并在此基础上,结合常规PCR和SON-PCR向该基因的两侧延伸,最终获得了11787bp的DNA序列,该序列包含了两个基因,其中序列较长的那个基因即为目的基因,该基因ORF长度为7304bp,包含了10个外显子,9个内含子,预测编码2038个氨基酸。该基因与紫色红曲菌（Monascus purpureus）pksl （AJ414729,7144bp）的DNA序列高度同源,相似性高达91%。将其内含子去除后进行BlastX比对,通过分析预测,该基因可能与红曲菌产色素的合成有关。根据预测的氨基酸序列分析,Mrpks10是由KS （Ketoacyl synthase）, AT （Acyl transf erase）, ACP （Acyl carrier protein）以及TE （Thioesterase）四个功能域组成,且属于非还原PKS类（Non-reducing PKS）。2. Mrpksl0基因的敲除以潮霉素抗性基因为筛选标记,构建了Mrpks10的同源重组敲除载体,并采用农杆菌介导的转化方法转化M-7,然后通过PCR从转化子中分离筛选出敲除子,并采用Southern杂交技术对其进行进一步验证,得到了一株敲除突变子ΔMrpks10。3.Mrpks10功能的初步分析为进一步明确该基因在M-7生长发育过程中的作用,对△Mrpksl0进行了相关基本生物学性状的研究,包括了菌落的颜色和形态的观察、分生孢子、闭囊壳以及菌丝结构的观察、桔霉素与胞内、胞外红曲色素含量的测定。结果表明,△Mrpksl0与M-7在这些生物学性状上没有明显的差异,从而初步推测Mrpksl0可能发生了基因沉默。为确定该基因确实发生了沉默,通过RT-PCR进一步加以验证,结果表明该基因确实在（?）nRNA水平不能表达。

论文目录

• 目录
• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 第一章 文献综述
• 1 红曲菌
• 1.1 红曲菌概况
• 1.2 红曲菌的主要代谢产物
• 1.2.1 红曲色素
• 1.2.2 桔霉素
• 1.2.3 Monaclin K及其它代谢产物
• 2 聚酮合酶
• 2.1 聚酮化合物
• 2.2 聚酮合酶
• 2.2.1 聚酮合酶的分类
• 2.2.2 真菌聚酮合酶
• 2.3 红曲菌pks基因的研究进展
• 3 基因沉默
• 3.1 基因沉默简介
• 3.1.2 转录水平基因沉默
• 3.1.2 转录后水平基因沉默
• 3.1.3 染色质水平上的基因沉默
• 3.2 沉默基因的激活
• 3.3 PKS的基因沉默及其激活
• 3.4 基因沉默的应用前景
• 4 研究目的与意义
• 第二章 红色红曲菌M-7Mrpks10基因的克隆及其分析
• 1 材料
• 1.1 菌株
• 1.2 主要试剂
• 1.3 培养基
• 1.4 主要仪器与设备
• 2 方法
• 2.1 红色红曲菌M-7聚酮合酶基因（Mrpks10）片段的克隆
• 2.1.1 简并引物的设计
• 2.1.2 红曲菌基因组DNA的提取
• 2.1.3 Mrpks10基因片段的扩增
• 2.1.4 PCR产物的回收、连接、转化和测序
• 2.2 Mrpks10侧翼序列的延伸
• 2.2.1 常规PCR扩增Mrpks10基因片段的侧翼序列
• 2.2.2 SON-PCR继续延伸Mrpks10基因片段的侧翼序列
• 2.2.3 序列的拼接及其分析
• 2.2.4 Mrpks10的系统进化树分析
• 3 结果与分析
• 3.1 Mrpks10基因片段的克隆
• 3.2 测序及其分析
• 3.3 Mrpks10侧翼序列的延伸
• 3.3.1 常规PCR扩增Mrpks10侧翼序列
• 3.3.2 SON-PCR继续扩增Mrpks10侧翼序列
• 3.4 序列拼接及分析
• 3.5 Mrpks10的系统进化树分析
• 4 小结与讨论
• 4.1 小结
• 4.2 讨论
• 第三章 红色红曲菌Mrpks10基因的敲除
• 1 材料
• 1.1 菌株与质粒
• 1.2 主要试剂
• 1.3 农杆菌介导的转化所需试剂和培养基
• 1.4 主要仪器与设备
• 2 方法
• 2.1 构建重组敲除载体
• 2.1.1 构建敲除盒
• 2.1.2 构建敲除载体
• 2.2 敲除载体转化农杆菌
• 2.2.1 农杆菌感受态的制备
• 2.2.2 农杆菌的转化
• 2.3 农杆菌介导的红曲菌转化
• 2.3.1 红曲菌孢子的收集
• 2.3.2 农杆菌的诱导
• 2.3.3 红曲菌孢子与农杆菌共培养
• 2.3.4 转化子的筛选
• 2.4 ΔMrpks10的筛选及其验证
• 2.4.1 PCR筛选红曲菌ΔMrpks10
• 2.4.2 Southern杂交验证ΔMrpks10
• 3 结果与分析
• 3.1 构建敲除盒
• 3.2 Mrpks10敲除载体的构建及验证
• 3.3 敲除载体转化农杆菌
• 3.4 ΔMrpks10的PCR筛选与验证
• 3.5 ΔMrpks10的Southern杂交验证
• 4 小结与讨论
• 4.1 小结
• 4.2 讨论
• 第四章 红色红曲菌M-7Mrpks10功能的初步研究
• 1 材料
• 1.1 菌株
• 1.2 主要仪器
• 1.3 主要试剂
• 1.4 培养基
• 2 方法
• 2.1 转化子的形态观察
• 2.1.1 ΔMrpks10的菌落形态观察
• 2.1.2 ΔMrpks10的显微特征观察
• 2.2 ΔMrpks10的主要代谢产物的分析测定
• 2.2.1 制备孢子悬液
• 2.2.2 液态发酵培养
• 2.2.3 桔霉素检测
• 2.2.4 红曲色素的检测
• 3 结果与分析
• 3.1 ΔMrpks10与M-7菌落形态比较
• 3.2 ΔMrpks10与M-7显微形态比较
• 3.3 ΔMrpks10与M-7的桔霉素分析
• 3.4 ΔMrpks10与M-7的色素分析
• 4 小结与讨论
• 4.1 小结
• 4.2 讨论
• 第五章 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 5.3 创新点
• 参考文献
• 附录1 Mrpks10的DNA序列
• 附录2 Mrpks10编码的氨基酸序列
• 致谢