论文摘要
近年来,甲状腺癌的发病率呈上升趋势,以乳头状癌的升高最为明显。甲状腺乳头状癌是最常见的甲状腺恶性肿瘤,约占所有甲状腺恶性肿瘤的60-80%,占全身恶性肿瘤的1.0-1.5%。甲状腺乳头状癌存在增殖失控、凋亡受阻等生物学特性,且侵袭能力较强,淋巴结转移率高,术后复发率较高,二次手术效果不佳,目前尚缺乏内科及生物学治疗方法。X-连锁凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP）是凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein,IAP）家族最重要的成员之一,它被认为是家族中最具有特征性及功能最强的内源性Caspase抑制因子,在生理学上是细胞死亡的关键性调节因子。研究显示,XIAP在正常的组织中呈低表达或不表达状态,而在多种恶性肿瘤中高表达,如在肺癌、胸腺癌、胰腺癌、宫颈癌,白血病中高表达,在卵巢癌也有许多相关报告。体外试验及动物实验均研究表明,XIAP通过抑制细胞凋亡及促进细胞增殖、生存、迁移、侵袭及肿瘤血管形成等在肿瘤发生发展过程中发挥瘤基因的重要作用。由于XIAP在恶性肿瘤中过表达,而在正常的组织中低表达甚至不表达,且最新研究显示敲除正常大鼠XIAP基因后大鼠未发现明显病理变化,提示敲除XIAP可能对正常细胞无毒性。基于以上特性,XIAP基因被认为是具有潜力的肿瘤治疗靶点,已成为肿瘤治疗和药物开发的热门靶基因。RNAi是近几年发展起来的新技术,是外源性和内源性双链RNA在生物体内诱导同源靶基因的mRNA特异性降解,导致转录后基因沉默的现象。RNAi具有高度序列特异性、抑制基因表达的高效性、稳定性及可传播性。目前常用的RNAi实验方法由直接转染双链siRNA及载体（质粒或病毒）表达发卡RNA两种,由于慢病毒载体能转染分裂期与非分裂期细胞,具有转染率高,基因抑制表达作用强,持续时间长等特性,且病毒的遗传物质能整合到宿主的基因组。通过慢病毒载体介导的RNAi,使长效抑制目的基因表达成为可能。尽管目前已经证明XIAP与某些恶性肿瘤发生发展存在密切相关,而且也展现出作为肿瘤治疗靶点的潜力,但目前有关甲状腺乳头状癌与XIAP之间的文献较少,为此我们研究XIAP在甲状腺乳头状癌中的表达情况及用RNAi对其细胞生物行为的影响,以期对甲状腺乳头状癌提出新的生物学治疗策略。第一部分XIAP在甲状腺乳头状癌中的表达及意义1.目的（1）检测XIAP在甲状腺乳头状癌、甲状腺腺瘤及正常甲状腺组织中的表达（2）研究XIAP的表达与甲状腺乳头状癌临床病理参数的关系2.材料与方法（1）收集病例资料:收集本院接受手术并病理证实甲状腺乳头状癌、甲状腺腺瘤及甲状腺正常组织标本,详细记录病人资料。（2）研究XIAP在甲状腺乳头状癌、甲状腺腺瘤及甲状腺正常组织的表达:免疫组织化学染色法。3.结果（1）XIAP在甲状腺乳头状癌组织中是高表达的,81.6%（40/49）标本为阳性表达。（2）对49例甲状腺乳头状癌患者的临床资料进行卡方检验及t检验,研究XIAP与临床病理参数之间的关系。男性患者中XIAP阳性率为76.9%（10/13）,女性患者中XIAP阳性率为80.6%（29/36）,两组之间无显著性差异（P=0.780）。XIAP阳性表达患者年龄为46.18±15.24岁, XIAP阴性表达患者年龄为43.22±11.35岁,两组之间无显著性差异（P=0.520）。术前发生淋巴结转移XIAP阳性表达率为86.7%（13/15）,术前未发生淋巴结转移XIAP阳性表达率为79.4% （27/34）,两组之间不存在显著性差异（P=0.546）。XIAP阳性表达患者肿瘤直径为1.98±0.59厘米, XIAP阴性表达患者肿瘤直径为1.53±0.52厘米,两组之间有显著性差异（P=0.041）。术前发生甲状腺外浸润XIAP阳性表达率为95.4%（21/22）,术前未发生甲状腺外浸润XIAP阳性表达率为70.4%（19/27）,两组之间存在显著性差异（P=0.024）。处于疾病早期（Early stage,I+II期）的甲状腺乳头状癌患者中XIAP阳性率为69.6%（16/23）,进展期（Advanced stage,III+IV期）甲状腺乳头状癌患者中XIAP阳性率为92.3% （24/26）,两组相比有显著性差异（P=0.040）,进展期XIAP表达水平高于早期。经典型的甲状腺乳头状癌患者中XIAP阳性率为63.2%（12/19）,滤泡型的甲状腺乳头状癌患者中XIAP阳性率为92.8%（13/14）,其它型的甲状腺乳头状癌患者中XIAP阳性率为93.7%（15/16）,其中经典型与滤泡型、其它型相比有显著性差异（P分别为0.045、0.031）,经典型XIAP阳性率低于滤泡型及其它型;而滤泡型、其它型患者XIAP阳性率无显著性差异（P=0.922）。（3） Spearman相关性分析:XIAP与肿瘤直径（r=0.328,P=0.031）、甲状腺外浸润（r=0.317,P=0.037）、临床分期（r=0.289,P=0.046）呈正相关关系。4.结论（1） XIAP在甲状腺乳头状癌组织中是高表达的,81.6%（40/49）标本为阳性表达。（2） XIAP的表达在不同肿瘤大小、是否浸润、临床分期、病理类型的患者之间有显著性差异,而在不同的性别、不同年龄的患者、是否转移无显著性差异。（3） Spearman相关性分析,XIAP与肿瘤大小、浸润、临床分期呈正相关。第二部分慢病毒介导的甲状腺乳头状癌细胞XIAP基因沉默1.目的（1）构建针对XIAP慢病毒介导的干扰载体,并生产高滴度慢病毒颗粒。（2）观察慢病毒转染甲状腺乳头状癌细胞株后XIAP的表达情况,从而筛选出最有效的shRNA。2.材料与方法（1）针对XIAP慢病毒介导的干扰载体的构建:采用吉凯基因公司的慢病毒载体系统,构建针对目的基因的RNA干扰慢病毒载体。（2） RNA干扰慢病毒的生产及滴度测定:三种质粒共转染293T细胞生产病毒,使用梯度稀释法测定滴度。（3）使用Real-time PCR和Western Blot筛选高效干扰序列。3.结果:（1）成功构建针对XIAP慢病毒介导的干扰载体。（2）包装生产了浓度为2×108TU/ml慢病毒颗粒,K1及CGTH W3的MOI值分别为10和20。（3）成功筛选出高效干扰序列,在K1细胞系中,XIAP mRNA水平降低79%,蛋白水平降低了87%;在CGTH W3细胞系中,XIAP mRNA水平降低了72%,蛋白水平降低了76%。4.结论（1）成功构建XIAP特异的RNAi慢病毒表达质粒载体。（2）包装并生产高滴度的慢病毒颗粒。（3）利用Real-Time PCR和Western Blot筛选高效干扰序列,经慢病毒转染后XIAP基因mRNA和蛋白水平显著被抑制。第三部分XIAP基因沉默对甲状腺乳头状癌生物学行为影响1.目的（1）观察XIAP基因沉默对细胞增殖的影响（2）分析XIAP基因沉默对细胞周期的影响（3）探讨XIAP基因沉默对细胞凋亡的影响（4）研究XIAP基因沉默对细胞侵袭的影响2.材料与方法（1）细胞增殖实验:采用MTT法评价XIAP基因沉默后对细胞增殖的影响。（2）细胞周期分析:利用流式细胞术测定细胞DNA含量,Modtif软件分析细胞周期。（3）细胞凋亡实验:采用Annexin-IV和PI双染流式细胞仪分析XIAP基因沉默后对细胞凋亡的影响,并用Western blot检测细胞凋亡相关蛋白及Real-time PCR检测细胞凋亡相关基因的表达情况。（4）细胞侵袭能力实验:利用Transwell实验评价XIAP基因沉默后细胞的侵袭能力。3.结果（1） XIAP基因沉默细胞增殖分别降低51%、43%,明显低于未干预组;阴性对照慢病毒感染组的细胞增殖未受明显影响。（2） XIAP基因沉默细胞G2/M期分别增加18.4%、14.1%,与未干预组及阴性对照慢病毒感染组相比有显著性差异。（3） XIAP基因沉默细胞凋亡率分别增加14.2%、8.4%,与未干预组及阴性对照慢病毒感染组相比有显著性差异。（4） XIAP基因沉默细胞穿膜能力分别降低50.7%、44.9%,明显低于未干预组及阴性对照慢病毒感染组。4.结论（1）敲除XIAP基因可抑制甲状腺乳头状癌细胞增殖,使其滞留在G2/M期。（2）沉默XIAP基因可促进甲状腺乳头状癌细胞凋亡。（3）静默XIAP基因可抑制甲状腺乳头状癌细胞侵袭。