论文摘要
增生性玻璃体视网膜病变（proliferative vitreoretinopathy，PVR）是指在孔源性视网膜脱离或视网膜复位手术后，由于玻璃体腔和视网膜表面广泛纤维增生膜收缩，最终形成牵拉性视网膜脱离的病变。是裂孔源性视网膜脱离手术失败最常见的原因，也是外伤导致视力丧失的重要原因。PVR的发病机制目前还未完全清楚，但其发生发展的病理过程已经明确。PVR作为一个损伤修复过程，其形成过程可划分为炎症期、细胞增生期和瘢痕期3个时期。参与PVR增生的细胞主要是视网膜色素上皮细胞（retinal pigment epithelium，RPE）和视网膜神经胶质细胞，其在细胞因子及细胞外基质等刺激因素的作用下，增生、迁移至视网膜表面及玻璃体腔，附着于一切可能的界面，并发生收缩。RPE细胞的主要作用为合成胶原及其他细胞外基质，能够收缩产生牵拉力，从而造成视网膜脱离。所以RPE细胞在PVR的发生过程中起着至关重要的作用。因此，PVR的药物治疗也多从RPE细胞入手，通过抑制RPE细胞的移行及增生来达到治疗目的。辛伐他汀（simvastatin）是一种3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A（3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-coenzyme A，HMG-CoA）还原酶抑制药，目前临床用于治疗高胆固醇血症，具有良好的治疗效果。近年来，有关HMG-CoA还原酶抑制药物的研究日益增多，实验表明此类药物可抑制多种细胞增生。本实验旨在观察辛伐他汀对体外培养牛视网膜色素上皮细胞（bovine retinal pigment epithelium，bRPE）增生作用的影响，从而探讨一种新的玻璃体视网膜增生性疾病的药物治疗方法。材料与方法1．细胞培养取健康无眼疾的小牛眼球，小牛处死后立即取眼球，4小时内分离RPE细胞进行培养：无菌条件下，沿角巩膜缘后5mm处环形剪开眼球壁，弃去眼前节和玻璃体，用显微镊仔细分离视网膜神经上皮层自视盘处将其剪除，暴露RPE层，用灭菌PBS冲洗眼杯3次，滴加0.25％胰蛋白酶溶液，置于37℃孵育箱消化30～60分钟。取出眼杯，用吸管反复吹打RPE面使细胞脱落，收集RPE细胞悬液，移入无菌离心管中，加入含20％胎牛血清的DMEM高糖培养液终止消化；以1000r／min离心5min；弃去上清液，加入含20％胎牛血清的DMEM高糖培养液，反复吹打制成细胞悬液，接种于25ml培养瓶中，置于5％CO2、饱和湿度的37℃细胞培养箱中培养；每3～5天换一次培养液，直至细胞融合传代。选第3～6代细胞用于实验，细胞鉴定采用链霉亲合素-生物素化过氧化物酶复合物（SABC）法，一抗为鼠抗人细胞角蛋白单克隆抗体，行免疫细胞化学染色进行细胞鉴定。2．实验药物辛伐他汀3．细胞形态学观察倒置显微镜下观察RPE细胞形态，并照相记录。4．RPE细胞体外药物敏感试验--MTT试验选第3～6代细胞用于实验，调整细胞密度为4～5×104／ml，接种于96孔培养板中，每孔接种200μl。孵育24h细胞贴壁后进行分组实验，对照组单纯用含10％胎牛血清的DMEM培养液，实验组根据加入辛伐他汀浓度的不同分为4组（浓度分别为1μmol／L，5μmol／L，10μmol／L，50μmol／L），每个浓度设3个复孔，分别培养24h、48h、72h，每孔加入MTT 20μl（5mg／ml），继续培养4小时，弃去上清液，加入DMSO 150μl，震荡均匀，15分钟后在酶联免疫检测仪490nm处测A值。5．统计学分析实验数据以均数±标准差（（?）±s）表示，应用SPSS10.0统计软件中One-way ANOVA进行检验。结果1．RPE细胞形态观察及鉴定原代培养的RPE细胞呈不规则形或扁平多角形，可见清晰的透明细胞核，胞浆内富含黑色素颗粒。1～2周后细胞渐融合，细胞浆变淡，细胞呈不规则形。传代2～3次后黑色素颗粒显著减少或消失，细胞呈梭形及不规则形。传代细胞铺满约需3～5天。角蛋白免疫化学染色胞浆呈特异性棕黄色，呈阳性反应。2．辛伐他汀对细胞形态学的影响倒置显微镜下观察，对照组可见对照组细胞呈贴壁生长，悬浮细胞少，细胞呈梭形或多角形，排列均匀。实验组观察发现细胞数有随浓度增加而相对减少的趋势。细胞形态不规则，体积缩小，悬浮细胞增多。3．MTT实验结果不同浓度的辛伐他汀作用于RPE细胞不同时间后，细胞生长受到不同程度的抑制。MTT法测得各实验组及对照组吸光度A值显示，随着药物浓度的增加和时间的延长，细胞A值减少，存活率降低。不同作用时间各实验组与对照组之间吸光度比较有统计学意义的药物剂量分别为：24h为5μmol／L有统计学意义，48h为5μmol／L有统计学意义，72h为1μmol／L有统计学意义。细胞增生抑制率随浓度增加和时间延长而升高。在一定浓度范围内，药物的抑制作用有浓度-时间依赖关系。结论辛伐他汀能够抑制体外培养的牛视网膜色素上皮细胞增生，且这种抑制作用呈剂量依赖性，可能为药物防治增生性玻璃体视网膜病变提供新方法。
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