论文摘要
食管癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，多发于亚洲和非洲，其发病有明显的种族人群差异。食管癌分为食管腺癌（Esophageal Adenocarcinoma, EA）和食管鳞状细胞癌（Esophageal Squamous Cell Carcinoma, ESCC），中国是食管癌的高发区，以食管鳞状细胞癌为主。但不同地区食管癌的发病类型和发病率也不相同。中国食管癌高发区主要分布于河南、河北、山西、陕西、四川以及东部地区，其中河南省主要以家族遗传性为主，而西南地区主要显示出散发性特征。重庆地处四川盆地东南部，为食管癌高发区之一。根据重庆市城市居民恶性肿瘤死因分析报告，在恶性肿瘤中，食管癌死亡率为25.85／10万，占13.37%。目前，食管癌术后5年生存率仅为18-30%，是高致死性的疾病。因此，研究其发病机理，寻找早期诊断及治疗的靶点是现今亟待解决的问题。食管癌是基因-基因、基因-环境因素相互作用的结果。大量的研究表明，人群遗传背景的基因多态性可以通过影响相关基因的功能，对肿瘤易感性发挥重要的作用。在人类基因组计划以及千人基因组计划取得巨大成就的背景下，以单核苷酸多态性（SingleNucleotide Polymorphism，SNP）为标记进行肿瘤等常见复杂疾病的遗传易感性研究取得了巨大的进展，其中包括候选基因的关联分析（Candidate gene Association Study）和全基因组关联分析（Genome-WideAssociation Study，GWAS）两种策略，关联分析已成为后基因组时代复杂疾病遗传学研究的热点之一。因此，结合中国西南地区食管鳞癌人群病例样本和相应的临床资料，探讨食管鳞癌的遗传易感性，对深入认识食管鳞癌的病因及发病机制，发掘食管鳞癌易感的遗传标志，提高食管鳞癌的预防和治疗水平具有重要的意义。MicroRNA（miRNA）是一类内源性的长度约22个核苷酸的非编码RNA，作为一种基因表达调控分子，参与调节细胞代谢、增殖、分化和凋亡等基本生命活动。研究表明，miRNA的突变或者表达异常与多种人类肿瘤相关，miRNA可以调控重要的肿瘤相关基因，发挥肿瘤抑制基因或者癌基因的功能，在肿瘤的发生发展中起重要作用，对肿瘤的诊断和治疗也具有重要意义。成熟的miRNA是由RNA聚合酶Ⅱ（PolⅡ）转录产生初级转录产物primary-miRNA（pri-miRNA），经RNaseⅢ Drosha和RNaseⅢ Dicer剪切加工生成。成熟的miRNA与Ago等蛋白一起组成RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC），通过与其靶基因3’非翻译区（UntranslatedRegion，UTR）的互补结合，降解靶基因的mRNA或抑制其翻译，从而调控基因的表达。miRNA主要依赖其seed区（2-8碱基）与靶基因的3＇UTR互补结合，结合位点序列决定了miRNA发挥作用的特异性。因此，任何对miRNA基因的转录、加工成熟及其与靶基因结合等环节产生影响的因素，都将导致miRNA表达或功能改变，与疾病的发生发展相关。迄今为止，应用SNP关联分析进行基因多态性与食管癌易感性研究已取得很大进展。大多数报道的与食管癌相关联的SNP位点位于基因的启动子和外显子区，对基因3＇UTR的SNP位点，以及miRNA基因的SNP位点的研究还较少。目前，HapMAP数据库公布人类基因组中大约存在1,500万个常见的SNP。在全基因组范围内，编码miRNA的基因及多数蛋白编码基因的3＇UTR也存在大量的SNP位点，这些SNP位点可能会影响miRNA的转录、加工生成，或影响miRNA与靶基因3＇UTR结合能力的变化甚至是结合位点的改变，从而导致所调控的靶基因表达或功能改变，影响个体对肿瘤的易感性。因此，结合miRNA基因的产生过程以及作用方式，本课题从编码miRNA基因的SNP，及蛋白编码基因3＇UTR的miRNA结合位点SNPs两个方面，采用候选基因SNPs关联分析策略，探讨发掘与中国西南地区食管鳞癌遗传易感相关的SNPs，并对阳性关联SNP位点进行功能研究。本课题的主要研究内容和结果如下：1. RAP1A基因3＇UTR的SNP rs6573与食管鳞癌发病及转移风险显著相关。首先通过生物信息学以及文献资料，筛选出与食管癌发生发展相关的基因。综合利用Diana-microT、Target-scan、miRBase、miRanda、PicTar以及microinspector预测miRNA的结合位点。在NCBI的dbSNP数据库（Build130）中对miRNA靶基因的3＇UTR进行BLAST和BLAST-SNP，然后使用RNAhybrid工具中的自由能总值（△△G）评价这些SNP对“miRNA-靶基因”相互作用的影响。在HapMAP数据库中查看这些SNP在中国汉族人群中的频率，筛选标准：MAF>5%。依据上述方法和原则，我们选取了BIRC5、FGF2、RAP1A、TGFA、DICER、COL4A2和DGCR8基因的7个miRNA靶点相关的SNPs位点。利用537例ESCC病例及608例正常对照，通过SNapShot基因分型及关联分析，研究SNPs位点多态性与ESCC的发生及转移风险性之间的关联性，结果显示：位于RAP1A基因3′UTR区的SNP rs6573C/A位点与ESCC的发病相关，多因素的logistic回归分析发现SNP rs6573的CC基因型的患病风险高于CA （OR,0.31;95%CI:0.23–0.41）或AA基因型（OR,0.43;95%CI:0.21–0.91）,提示C等位基因是ESCC的风险等位。进一步对临床分期进行分层分析，rs6573C/A等位基因在不同的临床分期之间的分布均显示出差异（P=0.03, OR=1.89;95%CI:1.06–3.36），提示此位点与食管鳞癌的临床分期存在关联。2. SNP rs6573通过影响miR-196a对RAP1A的表达调控参与了食管鳞癌的转移。RAP1A属于小分子G蛋白Ras超家族成员之一，在调控细胞生长，迁移和形态改变中都发挥着十分重要的作用，其表达及活性异常与肿瘤的发生及转移相关。生物信息学分析SNP rs6573位点位于RAP1A基因的3＇UTR区，存在于miR-196a潜在结合区，提示RAP1A基因表达可能受到miR-196a调控，SNP rs6573A/C等位变异可影响miR-196a与对RAP1A的调控作用。我们对SNP rs6573A/C的功能研究取得以下结果：（1）通过构建SNP rs6573A/C不同基因型RAP1A3＇UTR的载体，采用荧光素酶报告基因的方法研究发现，miR-196a可以显著降低A等位基因的荧光素酶活性，而对C等位基因的荧光素酶活性没有影响。进一步通过转染miR-196a mimics到不同基因型的细胞株中，发现，miRNA-196a可以降低AC杂合子细胞株的RAP1A的mRNA以及蛋白的表达，而对CC纯合子基因型的细胞没有作用。（2）通过检测食管鳞癌组织中RAP1A的蛋白表达发现，在大部分的食管鳞癌组织中RAP1A的表达都比相邻正常组织表达高，另外CC基因型的组织RAP1A的表达比AC以及AA基因型的表达高，存在淋巴结转移的组织RAP1A的表达比不存在淋巴结转移的组织表达高。（3）通过体外过表达或RAP1AsiRNA干扰等实验，发现RAP1A对食管癌细胞的增殖没有显著影响，但能促进食管癌细胞的迁移与侵袭。过表达RAP1A后可以增加MMP2蛋白的表达而促进食管癌细胞株的迁移与侵袭，而过表达miR-196a、siRNA干扰RAP1A、过表达RAP1A的活性抑制基因GAP后降低了MMP2蛋白的表达而抑制了食管癌细胞株的迁移与侵袭。上述研究结果表明： RAP1A是受miR-196a调控的一个新的靶基因，rs6573A/C多态性位点影响miR-196a对RAP1A的结合及调控作用。RAP1A可以通过增加MMP2的表达促进食管癌细胞株的迁移与侵袭，因此rs6573C等位基因通过增加RAP1A的表达而提高了食管癌转移的风险。本研究结果证明了SNP rs6573通过影响miR-196a对RAP1A的表达调控参与了食管鳞癌的侵袭与转移。3. SNP rs11614913通过影响miR-196a的生成与食管鳞癌显著相关。已有的研究表明，miR-196a的异常表达与多种肿瘤的发生发展相关，miRNA编码基因的SNP位点可能会影响miRNA的转录或生成，影响个体对肿瘤的易感性。通过生物信息学分析发现，位于miR-196a的前体区存在一个SNP位点（pre-miR-196-a2的rs11614913）。为探讨此SNP rs11614913多态性位点与食管鳞癌易感性的关系，我们采用SNapShot方法，在458例病例及489例正常对照人群中进行了基因分型及关联分析。结果显示：SNP rs11614913CC基因型比TT基因型显著增加了食管鳞癌的发病风险（OR：2.67;95%CI：1.77–4.04）；但与不同的临床分期无差异（p=0.38）；SNP rs11614913与食管鳞癌发病的关联在吸烟人群（OR：3.27;95%CI：1.97–5.40）比非吸烟人群（OR1.70;95%CI：0.99–1.70）关联性强，提示吸烟与此SNP位点可能存在交互作用。为探讨SNP rs11614913的生物学功能，我们通过构建不同基因型的miR-196a表达载体，转染细胞后RT-PCR检测发现，携带C等位基因的载体成熟miR-196a的表达明显高于T等位基因的载体，但pre-miR-196a的表达量没有差别。结果提示SNP rs11614913不影响pre-miR-196a的转录表达，而可能影响pre-miR-196a到miR-196a的成熟过程。我们进一步以体外转录不同基因型的pre-miR-196a为探针，通过RNA-protein pull-down与质谱分析发现：C等位基因的pre-miR-196a可以与蛋白NonO（non-POU-domain-containing, octamer-binding protein，p54nrb）结合，而T等位基因的pre-miR-196a不能与此蛋白结合。结果提示SNP rs11614913的C等位基因可能通过与NonO蛋白结合而促进了pre-miR-196a的转运或者增加其剪切，增加了成熟miR-196a的表达，从而与食管鳞癌的发生相关。具体的分子机制有待更深入的研究。综上所述，本课题从与肿瘤发生发展密切相关的miRNA基因以及miRNA靶基因两方面的SNP出发，通过大样本的病例-对照研究，发现RAP1A3＇UTR的miR-196a结合位点SNP rs6573和pre-miR-196a的SNP rs11614913两个SNP位点与中国西南地区食管鳞状细胞癌的发病风险显著相关，并证实了这两个SNP位点参与食管鳞癌发生及转移的生物学功能和机制。本研究结果为从遗传背景基础解析和认识食管鳞癌发生及转移的机制提供了新的证据，为评估食管鳞癌患者的转移风险性，进行个体诊断和治疗提供了新的线索。
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