新型纳米脂质体p27～（kipl）基因传递系统的研究

论文摘要

人类基因组计划的顺利完成，加速了功能基因的阐明和疾病相关基因的发现，也加深了人类从医学和生理学角度对自身的认识，使方兴未艾的基因治疗，成为21世纪生物医药领域的研究热点。 随着肿瘤发生发展的分子机制研究不断深入，人们逐渐认识到肿瘤的发生和发展是一个多因素、多步骤和多基因参与的复杂过程，细胞周期调控异常和细胞凋亡障碍则是其中最关键的两个分子事件。国内外大量研究表明，p27kip1低表达与肺癌的发生以及预后差有密切关系，p27基因可以作为治疗基因，用于肺癌的基因治疗。用基因传递载体携带p27基因治疗小鼠肺部肿瘤，国内外尚未见报道。 虽然近20年来基因治疗取得了很大的发展，但当前基因治疗研究中还存在很多技术性的难题，其中之一就是治疗基因的有效传输。目前的基因传递系统主要包括病毒载体和非病毒载体两大类。病毒载体虽然具有比较高的转染效率，但是它们的生物安全性问题至今尚未得到很好的解决。非病毒载体安全性高，易于大规模生产，其中阳离子脂质体的发展最为成熟。但是阳离子脂质体／DNA复合物（LPPs）不能将目的基因包裹在脂质体内部，稳定性较差，体内实验的效果欠佳，因此基因治疗对于新型非病毒基因传递系统的需要仍然十分迫切。 针对当前肺癌缺乏有效治疗手段的现状，本研究就利用细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p27kip1基因治疗小鼠肺癌，并联合化疗药物进行联合治疗进行了探讨。本课题系统地研究了载基因纳米脂质体（DNLs）的制备处方工艺条件，考察了其体内外转染能力及细胞毒性，并建立了小鼠肺转移肿瘤模型，用DNLs携带治疗基因，进行了体内外药效学研究，在此基础上，我们还对其体内外抗肿瘤效果进行了初步的机理研究。 我们首先利用转化的大肠杆菌DH5-α分别扩增了实验需要的报告基

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 质粒DNA的扩增、提取和纯化
• 1 仪器与试药
• 1.1 商品试剂盒与主要试剂
• 1.2 细菌培养基
• 1.3 主要溶液的配制
• 1.4 菌株和质粒
• 1.5 实验仪器
• 2 实验方法与结果
• 2.1 质粒DNA的扩增
• 2.2 质粒DNA的提取和纯化
• 2.3 质粒DNA的产量
• 2.4 质粒DNA的纯度分析
• 3 小结和讨论
• 3.1 基因治疗对质粒载体的要求
• 3.2 大规模分离纯化质粒DNA的关键操作
• 3.3 质粒DNA的分光光度法测定
• 3.4 基因治疗用质粒DNA的质量评价指标
• 第二部分 载基因纳米脂质体制备工艺的研究
• 1 仪器和试剂
• 1.1 主要试剂
• 1.2 实验仪器
• 2 实验方法与结果
• 2.1 质粒DNA含量测定方法的建立
• 2.2 载基因纳米脂质体的制备
• 3 小结和讨论
• 3.1 脂质体基因传递系统
• 3.2 荧光分光光度法测定DNA的含量
• 3.3 载基因纳米脂质体的制备方法
• 第三部分 载基因纳米脂质体体外细胞学试验研究
• 1 仪器与试剂
• 1.1 试剂盒与主要试剂
• 1.2 细胞株
• 1.3 细胞培养基及主要溶液的配制
• 1.4 实验仪器
• 2 实验方法
• 2.1 细胞复苏
• 2.2 细胞传代
• 2.3 细胞转染
• 2.4 X-gal染色观察pORF-LacZ的转染效果
• 2.5 pORF-LacZ的转染率测定
• 2.6 pEYFP-C1-P27转染效果的观察
• 2.7 pEYFP-C1-p27转染率的测定
• 2.8 空白纳米脂质体的细胞毒性研究
• 2.9 p27-DNLs对肿瘤细胞的生长抑制试验
• 2.10 p27-DNLs对肿瘤细胞细胞周期的影响
• 2.11 p27-DNLs对肿瘤细胞凋亡的影响
• 2.12 统计学分析
• 3 实验结果
• 3.1 β-半乳糖苷酶在肿瘤细胞中的表达
• 3.2 EYFP在肿瘤细胞中的表达
• 3.3 空白脂质体的细胞毒性评价
• 3.4 p27-DNLs对肿瘤细胞的生长抑制作用
• 3.5 p27-DNLs对肿瘤细胞细胞周期的影响
• 3.6 p27-DNLs对肿瘤细胞凋亡的影响
• 4 小结和讨论
• 4.1 报告基因
• 4.2 DNLs能够介导报告基因在肿瘤细胞中表达
• 4.3 BCA法测定蛋白的原理
• 4.4 四唑盐（MTT）比色法
• 4.5 空白脂质体对细胞无明显毒性
• 4.6 p27-DNLs可以明显抑制肿瘤细胞的生长
• 第四部分 载基因纳米脂质体冻干粉针剂的研究
• 1 仪器和试剂
• 1.1 主要仪器
• 1.2 主要试剂
• 2 方法与结果
• 2.1 DNLS冻干针剂的处方及制备工艺研究
• 2.2 DNLs冻干粉针剂质量评价
• 3 小结与讨论
• 3.1 冷冻干燥后的DNLs
• 3.2 冷冻干燥技术
• 3.3 冻干保护剂的作用
• 3.4 DNLs冻干粉针剂中DNA的生物活性
• 第五部分 p27-DNLs冻干粉针剂及p27-LPDs冻干粉针剂对肺转移肿瘤小鼠的治疗实验研究
• 1 仪器与试药
• 1.1 实验设备
• 1.2 主要试剂
• 1.3 实验动物
• 1.4 细胞株
• 2 实验方法与结果
• 2.1 pEYFP-C1-p27-DNLs冻干粉针剂在小鼠体内的表达分布研究
• 2.2 p27-LPDs冻干粉针剂的制备
• 2.3 小鼠肺转移肿瘤模型的建立
• 2.4 预试
• 2.5 给药
• 2.6 荷瘤小鼠的治疗效果观察
• 2.7 抗结肠癌肺转移作用观察
• 2.8 组织学及病理学观察
• 2.9 p27-DNLs冻干粉针剂及p27-LPDs冻干粉针剂体内抗肿瘤作用的初步机理探讨
• 2.10 统计学分析
• 3 实验结果
• 3.1 EYFP在小鼠体内的表达分布
• 3.2 p27-DNLs冻干粉针剂及p27-LPDs冻干粉针剂可以抑制结肠癌肺转移及肿瘤的生长
• 3.3 p27-DNLs冻干粉针剂及p27-LPDs冻干粉针剂可以延长荷瘤小鼠的生存周期
• kip1的表达'>3.4 免疫组化检测肺组织中p27^kip1的表达
• 3.5 p27-DNLs冻干粉针剂及p27-LPDs冻干粉针剂联合小剂量顺铂副作用的观察
• 4 小结和讨论
• 4.1 DNLs可以介导外源基因经静脉注射在小鼠体内表达
• 4.2 小鼠肺转移肿瘤模型的建立
• kip1体内基因治疗'>4.3 p27^kip1体内基因治疗
• 4.4 p27-DNLs冻干粉针剂及p27-LPDs冻干粉针剂联合小剂量顺铂治疗小鼠肺转移肿瘤
• 4.5 免疫组织化学检测目的蛋白在小鼠体内的表达
• 结论
• 综述
• 致谢
• 作者简介