全局转录工程选育耐受乳酸产物的基因工程菌研究

论文摘要

乳酸是一种天然的有机酸,乳酸及乳酸衍生物广泛应用于食品、医药、酿造、纺织等领域,其中以L-乳酸为原料合成的聚乳酸被认为是最有前途的可生物降解高分子材料。目前,因传统的乳酸菌育种中主要存在筛选周期较长、多价载体构建受限和难以获得全局最优目标表型等问题,限制了乳酸菌遗传育种的发展。为此,本研究基于细胞全局转录水平,采用融合PCR技术获得RNA聚合酶（RANP）的首要亚基-σ因子的表达序列,并采用易错PCR技术引入突变,获得转录突变库,筛选获得性能显著提升的细胞株。（1）克隆获得鼠李糖乳酸杆菌σ因子及其本源启动子;采用融合PCR方法获,得σ因子的表达序列;采用定点突变结合融合PCR的方法,在不改变阅读框架的前提下,成功突变了σ因子中的EcoRI酶切位点;采用易错PCR方法在σ因子的表达序列中引入随机突变并与乳酸菌组成型的表达载体pMG36e连接,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,获得突变文库。（2）不仅确定了噬淀粉乳酸杆菌B0112为本研究的最适受体菌株,还确定了最佳电转化条件:采用5%甘氨酸和0.5 mol/L蔗糖预处理细胞壁,待菌体生长到OD600达到0.6左右时收获细胞,并采用电转缓冲液EB2清洗三次后,制备成电转化感受态,在电压为1.5 kv的条件下,得到104数量级的阳性转化子。（3）在乳酸筛选压力下,得到优势菌株LA5,其生长速度快于对照C1和C2,推测可能是由于氨基酸的替换及C末端27个氨基酸的缺失,导致了σ因子的空间结构发生了变化,产生了一定的调控效果。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 乳酸的性质及其衍生物的应用
• 1.2 融合PCR 及易错PCR 技术研究进展
• 1.3 乳酸菌遗传育种研究进展
• 1.4 乳酸菌基因工程
• 1.5 本研究的目的和意义
• 2 σ因子完整表达序列及突变文库的构建
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 2.3 实验结果
• 2.4 讨论
• 2.5 本章小结
• 3 乳酸杆菌电转化条件的研究
• 3.1 实验材料
• 3.2 实验方法
• 3.3 实验结果
• 3.4 讨论
• 3.5 本章小结
• 4 全局转录工程筛选耐受乳酸产物的菌株
• 4.1 实验材料
• 4.2 实验方法
• 4.3 实验结果
• 4.4 讨论
• 4.5 本章小结
• 5 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录Ⅰ 攻读硕士期间发表论文及专利情况
• 附录Ⅱ