浙江地区副溶血弧菌分离株主要毒力基因分布特征及其相关基因表达研究

论文摘要

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus, Vp）是一种革兰氏阴性嗜盐菌,广泛分布于海洋、河口环境,尤其是近海鱼类、贝类等海产品中。人类食用被致病性副溶血弧菌污染或未煮熟的海产品可引起急性胃肠炎。近年来副溶血弧菌引发的食物中毒事件在日本、中国、新西兰、印尼、美国等不同国家和地区屡有发生,且其在沿海甚至内陆海产品中的分离率渐呈增长趋势。耐热直接溶血素TDH、耐热直接溶血素相关溶血素TRH、尿素酶、三型分泌系统被认为是副溶血弧菌的主要毒力因子,与副溶血弧菌的致病性有关。本论文的研究的目的是:（1）分析浙江沿海地区海产品及其养殖环境中副溶血弧菌的污染及耐药情况（2）分析副溶血弧菌环境分离株主要毒力基因的分布特征（3）比较副溶血弧菌在应激条件下的生长状况及tdh基因的表达差异;（4）初步探讨副溶血弧菌尿素酶表型与相关基因表达之间的关系。为了调查浙江沿海地区海产品及其养殖环境中副溶血弧菌的分布,分别在舟山、宁波、温州、台州四地采样566份,包括水样、泥样和海产品,其中395份样品中分离到副溶血弧菌,平均分离率达70%（395/566）,不同地区的分离率在63%-87%之间,不同来源样品间的检出率差异具有显著性。对2006-2008年从不同时间、不同区域海产品中分离保存的446株副溶血弧菌进行了耐药性检测,结果表明分离株对青霉素类、磺胺类药物耐药率高,其次为氨基糖苷类,对喹诺酮类、氯霉素类、四环素、头孢类药物敏感。比较08年与07、06年细菌的耐药情况,发现磺胺类药物的耐药情况明显减缓,阿莫西林、利福平、头孢类、部分氨基糖苷类药物的耐药率均上升。用PCR方法对分离自浙江省部分沿海地区的395株副溶血弧菌进行tdh、trh、ureC、vscC2、vcrD2等主要毒力基因的检测。结果表明395株分离株中,tdh、trh和ureC基因阳性率分别为10.1%、20%和11.1%。在40株tdh+菌株中,仅13株扩增到了vscC2基因,而79株trh+菌株只有44株含有ureC,其余35株ureC却为阴性。这说明trh与ureC并非完全连锁,而这44株trh+-ureC+菌株中,仅有6株尿素酶阳性。运用SpectraMax M2连续读谱仪在600nm波长下测定tdh阳性副溶血弧菌在不同浓度NaCl及不同pH环境中的生长情况,并以实时荧光定量PCR方法比较不同来源以及不同应激条件下副溶血弧菌tdh基因的表达差异。生长试验结果表明副溶血弧菌在10%NaCl中仍可生长,在12%浓度下逐渐死亡;在pH值不低于5.0时仍可生长;以酸盐共同作用时,10%NaCl和pH5.5便可抑制副溶血弧菌的生长。荧光定量PCR结果表明临床分离株的tdh基因mRNA表达量高于除F22外的海产品分离株;经过pH5.0的酸应激后,副溶血弧菌环境株和临床株其tdh mRNA表达量均上升（2-⊿⊿Ct>1）,临床株的上升量大于环境株上升量;经过10%NaCl应激后,除环境株X65外,其他菌株的tdh mRNA表达量也均有不同程度的上升,同样临床株上升量大于环境分离株上升量。为探讨尿素酶表型与trh、ure等相关基因之间的关系,本研究对前期所有经鉴定trh和ureC阳性的菌株进行trh-nik-ure cluster区域基因的PCR扩增,并运用Real-time PCR方法检测不同菌株或处理方法下其trh、ureC、ureR基因mRNA水平上的差异。PCR结果显示包含trh和ure cluster的DNA区域存在于部分副溶血弧菌环境株中;尿素酶的表达并非需要完整的尿素酶基因簇,除trh和结构基因ureC外,至少还需要nikE、ureR基因的参与;荧光定量PCR结果表明产尿素酶菌株比不产尿素酶菌株的trh和ureC表达量都高;添加尿素组ureR基因比不添加尿素的表达量高。提示尿素酶表达系统是一个由多基因调控的复杂系统,其中可能的机制是这种只存在于尿素酶阳性菌株中的正调节子ureR通过影响部分ure、nik基因来参与尿素酶及TRH的表达。总之,本试验通过对沿海地区副溶血弧菌的分布特征、耐药状况、主要毒力基因及表型特征、在高盐和酸性环境中的生长及tdh表达、尿素酶表型与相关基因表达关系等方面进行研究,为今后进一步开展该菌对食品污染的风险性评估和致病机制的研究提供了一定的理论基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 第一章 副溶血弧菌研究进展
• 1.1 副溶血弧菌的主要生物学特性
• 1.1.1 培养特性
• 1.1.2 生长与栖息环境
• 1.2 副溶血弧菌的流行特征及耐药性研究
• 1.2.1 副溶血弧菌引起的人类食物中毒
• 1.2.2 副溶血弧菌在海产品中的污染状况
• 1.2.3 副溶血弧菌耐药性研究
• 1.3 副溶血弧菌检测技术研究进展
• 1.3.1 最大可能数法（MPN）
• 1.3.2 PCR 方法
• 1.3.3 核酸杂交法
• 1.3.4 显色培养基
• 1.3.5 酶联免疫吸附（ELISA）法
• 1.4 副溶血弧菌的毒力因子及致病机制
• 1.4.1 黏附因子与侵袭力
• 1.4.2 溶血性毒素（Helmolysin）
• 1.4.3 尿素酶（Ureases）
• 1.4.4 脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）
• 1.4.5 胞外酶
• 1.4.6 三型分泌系统（TTSS）
• 1.4.7 摄铁系统（Ferric uptake system）
• 1.5 副溶血弧菌的致病性及预防感染的措施
• 1.5.1 副溶血弧菌的致病性
• 1.5.2 预防副溶血弧菌感染的方法
• 1.6 实时荧光定量PCR 技术
• 1.6.1 实时荧光定量PCR 技术的原理及几个重要参数
• 1.6.2 实时荧光定量PCR 的分类
• 1.6.3 实时荧光定量PCR 的定量方法
• 1.6.4 实时荧光定量PCR 技术的应用
• 试验研究
• 第二章 浙江地区副溶血弧菌的分离鉴定及耐药性调查
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 引物的设计与合成
• 2.1.3 细菌基因组DNA 的提取
• 2.1.4 副溶血弧菌的双重PCR 鉴定
• 2.1.5 副溶血弧菌的甘油冷冻保藏法
• 2.1.6 副溶血弧菌体外药物敏感性测定
• 2.2 结果
• 2.2.1 海产品及其养殖环境中副溶血弧菌分布特征
• 2.2.2 2006-2008 年副溶血分离菌体外抗菌药物敏感性试验
• 2.3 讨论
• 第三章 浙江地区副溶血弧菌海产品及环境分离株的表型及毒力相关基因分析
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 引物的设计与合成
• 3.1.3 细菌基因组DNA 的提取
• 3.1.4 副溶血弧菌主要毒力基因的PCR 扩增
• 3.1.5 神奈川溶血试验
• 3.1.6 尿素酶试验
• 3.2 结果
• 3.2.1 副溶血弧菌毒力相关基因检测结果
• 3.2.2 副溶血弧菌的溶血与尿素酶表型
• 3.3 讨论
• 第四章 副溶血弧菌在应激条件下的生长及TDH 基因表达情况分析
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.2 结果
• 4.2.1 高浓度氯化钠培养条件下副溶血弧菌的生长情况
• 4.2.2 低pH 值培养条件下副溶血弧菌的生长情况
• 4.2.3 不同浓度氯化钠和不同pH 相互作用下副溶血弧菌的生长情况
• 4.2.4 应激对细菌tdh 基因转录水平的影响
• 4.3 讨论
• 第五章 副溶血弧菌尿素酶表型与相关基因表达的关系研究
• 5.1 材料和方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 引物的设计与合成
• 5.1.3 副溶血弧菌基因组DNA 的提取
• 5.1.4 副溶血弧菌trh-ure cluster 基因的PCR 扩增
• 5.1.5 副溶血弧菌cDNA 的获取
• 5.1.6 不同尿素酶表型菌株trh、ureC 基因表达水平的分析
• 5.1.7 尿素诱导与ureR 基因表达的关系的研究
• 5.2 结果
• 5.2.1 副溶血弧菌trh-ure cluster 基因的PCR 扩增结果
• 5.2.2 不同尿素酶表型菌株trh、ureC 基因表达水平的分析结果
• 5.2.3 尿素对ureR 基因表达量的影响
• 5.3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录1 常用试剂及培养基配方
• 附录2 部分浙江沿海地区海产品及环境分离株基因型与表型
• 致谢
• 个人简介