论文摘要
土壤盐渍化和次生盐渍化是影响农作物产量的一个重要因素。据统计,全世界至少有20%的耕地已经出现盐渍化。我国盐渍化土地的面积越来越大,这一现状已经成为制约我国农业发展的主要环境因素之一。大豆是一种重要的油料作物,其产量和品质受到盐胁迫的明显制约。因此,选育耐盐品种对于提高我国盐渍化地区大豆的产量潜力具有非常重要的意义。耐盐基因的定位和克隆将是促进大豆耐盐品种培育的有效途径之一本研究利用包含427个家系的重组自交系群体NJRIKY（科丰1号×南农1138-2）,采用低丰度（0.8 X）的全基因组重测序技术构建的包含4737个重组bin（分子标记）的高密度大豆遗传图谱（bin map）,对大豆幼苗期的耐盐相关性状进行QTL分析；同时通过耐盐候选基因的筛选,克隆了GmRPL23和GmAKR两个耐盐候选基因,并对它们进行生物信息学分析。研究结果如下：1、通过水培法,在植物培养室内培养（条件设定：白天14小时,温度为29℃；黑夜10小时,温度为23℃,相对湿度为70%）,当生长8天后（2天萌发+6天营养液培养）,分别用含0和150mM NaCl的Hoagland溶液培养6天,以各家系（每个家系6株）植株在。和150mM盐处理下的根长及干重为指标,进行相关QTL定位（实验重复3次）。共统计4个指标,分别为：正常生长情况下的根长即对照根长（CKRL）.正常生长情况下的干重即对照干重（CKDW）;以及耐盐指标相对根长即处理根长与对照根长的比值（RRL）、相对干重即处理干重与对照干重的比值（RDW）。结果显示这4个指标的遗传率分别为64.4%、86.2%;58.7%、78.4%。2、用QTL Network2.1进行幼苗期耐盐QTL定位,结果发现以相对根长（RRL）及相对干重（RDW）作为耐盐指标,在1、2、4、5、6、7、9、10、11、12、15、16和18号染色体上共检测到16个与幼苗期耐盐性相关的加性QTL位点,可解释的总遗传率为25.8%,置信区间的范围在1.1cM-2.6cM之间。此外,以相对根长（RRL）为指标共检测到4对上位性互作QTL,且这些互作的5个QTL（有3对重复的）均在加性QTL位点中检测到。通过与前人已经定位到的耐盐QTL对比,发现在18号染色体（G连锁群）上定位到的1个QTL位点（qrrll8-1）可能与Chen等（2008）定位到的1个位点（qpsdG.1）是同一个QTL,并将置信区间从21.5cM缩小至1.7cM。通过Soybase网站比较表明,在我们定位到的16个大豆幼苗期耐盐QTL中,有13个QTL的附近找到了已报道过的基因,且有许多都可能与耐盐相关（如过氧化物酶、MYB、bZIP、NAC类蛋白等）。这些结果与耐盐机制研究中发掘的耐盐基因相吻合。分别以相对根长、相对干重以及两者的均值排序分析424个家系的耐盐级别,结果都检测出WKY-133、 WKY-166、WKY-348、WKY-351、WKY-397、WKY-465、WKY-481和WKY-513这8个高度耐盐家系（耐盐等级为1级）。3、多个耐盐QTL研究都定位到了Gm03:40344151-Gm03:41800718这个区段,结合科丰1号和南农1138-2不同组织盐处理的RNA-seq数据（中科院遗传研究所陈受宜老师提供）,我们选择了3号染色体上Gm03:40118992..40846377之间724.4kb的基因区段作为候选基因挖掘的重点区段进行候选基因分析。在该区段内预测到81个基因,其中51个基因在南农1138-2与科丰1号之间存在SNP/Indel差异。通过功能注释及半定量相关实验,初步选取了6个基因,其中有2个有应答。以栽培大豆南农1138-2根、茎、叶的mRNA为模板,采用RT-PCR方法对6个基因进行分析,结果有2个基因在150mMNaCl胁迫下在南农1138-2根和叶等组织中的表达量均受到诱导。一个基因在南农1138-2根及叶中的表达量在盐处理12小时后有一个明显的上调,而在茎中表达量基本不变。另一个基因在南农1138-2根中的表达量在6小时后有一个明显的上调,而在叶中的表达量在盐处理24小时后有明显的上调,根据以上检测结果推测这两个基因可能与大豆响应耐盐相关。根据两个基因的功能对其命名,一个基因是60S核糖体蛋白（Ribosomal Protein L23）,通常参与蛋白质的合成,命名为GmRPL23。另一个基因是一个锚蛋白重复序列（Ankyrin Repeat-Containing）,有相关报道指出水稻的AKR5基因与耐逆相关,所以推测大豆的AKR基因也有近似的功能,命名为GmAKR.