论文题目: 生物法合成1，3-丙二醇的过程工程研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 生物化工
作者: 陈宏文
导师: 胡宗定,方柏山
关键词: 丙二醇,甘油脱氢酶,丙二醇氧化还原酶,辅酶截留,辅酶再生,酶膜反应器
文献来源: 天津大学
发表年度: 2005
论文摘要: 1,3-丙二醇(1,3-PD)是一种重要的化工原料,它可作为化学和医药工业中多种润滑剂、有机溶剂和前体的合成原料。它最主要的用途是作为新型聚酯(如PTT)、聚醚和聚亚氨酯的单体。1,3-PD的生产方法有化学法和生物转化法。近年来,生物转化法以其利用可再生资源、对环境友好等特点日益受到人们的重视。本论文以来源于克雷伯杆菌的甘油脱氢酶(GDH)和1,3-丙二醇氧化还原酶(PDOR)催化合成1,3-PD为目的,对酶的制备、酶促合成过程及无电荷超滤膜反应器设计进行了深入的研究,以期开辟一条生物法高效生产1,3-PD的新途径。有氧条件下,建立了细胞破碎和1,3-PD代谢途径中关键酶酶活力测定方法。通过应用均匀设计、人工神经网络和遗传算法优化培养基配方和培养条件优化,GDH、PDOR酶活力最终达到3700、3840U/L,为后续催化合成反应创造条件。在有氧条件下,采用离子交换层析和亲和层析两步法同时分离纯化了GDH和PDOR,为酶法合成1,3-PD提供酶源。克雷伯杆菌在含有盐酸氨基脲和甘油的磷酸盐缓冲液培养基中有氧发酵,可实现3-羟基丙醛(3-HPA)的转化,为酶法合成1,3-PD提供关键底物。建立同时测量甘油、3-HPA和1,3-PD、二羟基丙酮(DHA)的高效液相色谱分析方法。分别确定了GDH、PDOR酶促反应机制为Ordered BiBi,建立其分批条件下动力学模型。有氧分批条件下,伴随辅酶Ⅰ再生,实现酶法合成1,3-PD和DHA。构建无电荷超滤膜反应器,优化辅酶截留条件,提高辅酶截留率。研究克雷伯杆菌NaCS-PDMDAAC微胶囊生产1,3-PD。微胶囊细胞连续发酵10批,其生产能力为0.60g/L/h,是游离细胞的2.56倍。
论文目录:
第一章 文献综述
1.1 1,3-丙二醇概况
1.1.1 1,3-丙二醇的应用
1.1.2 1,3-丙二醇的合成方法
1.2 甘油转化生产1,3-丙二醇的菌种和代谢途径
1.3 生物转化生产1,3-丙二醇的生产能力
1.4 菌种的基因改造
1.5 甘油代谢关键酶的纯化、酶学性质以及分子机制
1.5.1 甘油脱氢酶
1.5.2 1,3-丙二醇氧化还原酶
1.5.3 甘油脱水酶
1.6 氧化还原酶催化过程中的辅酶连续再生和截留
1.6.1 辅酶再生方法
1.6.2 辅酶截留方法
1.7 本文主要研究内容和创新点
第二章 克雷伯杆菌生产1,3-丙二醇关键酶酶活力分析方法研究
2.1 材料和方法
2.1.1 菌种
2.1.2 试剂
2.1.3 主要仪器与设备
2.1.4 培养基
2.1.5 培养方法
2.1.6 无细胞抽提液的制备方法
2.1.7 分析方法
2.2 结果与讨论
2.2.1 GDH、PDOR、GDHt三种酶在细胞中的内外分布
2.2.2 细胞破碎条件的确定
2.2.3 反应pH对酶活力测定的影响
2.2.4 反应温度对酶活力测定的影响
2.2.5 GDH、PDOR初速度反应时间的确定
2.2.6 讨论
本章小结
第三章 克雷伯杆菌生产1,3-丙二醇关键酶发酵条件研究
3.1 材料和方法
3.1.1 菌种
3.1.2 主要仪器和设备
3.1.3 培养基
3.1.4 培养方法
3.1.5 无细胞抽提液的制备方法
3.1.6 分析方法
3.2 结果和讨论
3.2.1 培养基组份的选择
3.2.2 培养基优化
3.2.3 发酵工艺条件对产酶的影响
3.2.4 发酵过程的代谢曲线
3.2.5 讨论
本章小结
第四章 甘油脱氢酶和1,3-丙二醇氧化还原酶的纯化及性质研究
4.1 材料和方法
4.1.1 主要仪器和试剂
4.1.2 菌种
4.1.3 培养基
4.1.4 培养方法
4.1.5 无细胞抽提液的制备方法
4.1.6 酶活力测定
4.1.7 蛋白质含量测定
4.1.8 电泳分析
4.2 结果和讨论
4.2.1 GDH和PDOR纯化策略的确定
4.2.2 甘油脱氢酶的分离纯化
4.2.3 甘油脱氢酶的酶学性质
4.2.4 1,3-丙二醇氧化还原酶和甘油脱氢酶的分离纯化
4.2.5 1,3-丙二醇氧化还原酶的酶学性质
本章小结
第五章 克雷伯杆菌利用甘油有氧发酵生产3-羟基丙醛的研究
5.1 材料和方法
5.1.1 菌种
5.1.2 试剂和仪器
5.1.3 培养基
5.1.4 分析方法
5.2 结果和讨论
5.2.1 种子扩大培养时间对3-HPA发酵的影响
5.2.2 接种量对3-HPA发酵的影响
5.2.3 初始甘油浓度对3-HPA发酵的影响
5.2.4 盐酸氨基脲的含量对3-HPA发酵的影响
5.2.5 初始pH和温度对3-HPA发酵的影响
5.2.6 3-HPA发酵过程的代谢曲线
5.2.7 3-HPA稳定性的考察
5.3 讨论
本章小结
第六章 高效液相色谱法同时测定甘油、3-羟基丙醛、二羟基丙酮和1,3-丙二醇
6.1 材料和方法
6.1.1 试剂和仪器
6.1.2 色谱条件
6.1.3 样品制备
6.1.4 标准溶液配制
6.1.5 定性与定量
6.2 结果和讨论
6.2.1 检测器的选择
6.2.2 流动相的确定
6.2.3 甘油、1,3-丙二醇、二羟基丙酮和3-羟基丙醛的色谱行为
6.2.4 回归方程、相关系数及检出限
6.2.5 精密度的考察
6.2.6 回收率实验
本章小结
第七章甘油脱氢酶和1,3-丙二醇氧化还原酶反应机制和动力学
7.1 材料和方法
7.1.1 菌种
7.1.2 培养基和培养方法
7.1.3 无细胞抽提液的制备方法
7.1.4 甘油脱氢酶和1,3-丙二醇氧化还原酶的分离纯化
7.1.5 分批GDH、PDOR偶合酶催反应
7.1.6 Gly、3-HPA、1,3-PD和DHA的含量测定
7.2 结果与讨论
7.2.1 GDH双底物酶促反应机制
7.2.2 GDH双底物酶促反应速度方程及动力学常数求解
7.2.3 PDOR双底物酶促反应机制
7.2.4 PDOR 双底物酶促反应速度方程及动力学常数求解
7.2.5 分批操作条件下GDH、PDOR偶合催化合成1,3-PD和DHA
本章小结
第八章 克雷伯杆菌微胶囊化生产1,3-丙二醇的研究
8.1 材料和方法
8.1.1 菌种
8.1.2 原料和试剂
8.1.3 主要仪器与设备
8.1.4 培养基
8.1.5 培养方法
8.1.6 微胶囊的制备和培养方法
8.1.7 分析方法
8.2 结果和讨论
8.2.1 PDMDAAC对克雷伯杆菌生长的影响
8.2.2 NaCS-PDMDAAC微胶囊的制备方法优化
8.2.3 不同囊径微胶囊固定化多批次培养
8.3 讨论
本章小结
第九章 无电荷超滤膜酶膜反应器中辅酶截留的研究
9.1 材料和方法
9.1.1 试剂
9.1.2 主要仪器
9.1.3 酶膜反应器装置
9.1.4 辅酶含量测定、辅酶截留率和超滤流速的计算
9.1.5 酶活力测定
9.2 结果和讨论
9.2.1 不同PEI/ NAD+比例、不同缓冲溶液对NAD+的截留率影响
9.2.2 离子强度对辅酶截留率的影响
9.2.3 超滤膜中NAD+与NADH截留率比较
9.2.4 添加物牛血清白蛋白对辅酶截留率的影响
9.2.5 温度对超滤流速的影响
9.2.6 在不同离子强度下PEI对超滤流速的影响
9.2.7 PEI对GDH和PDOR酶活力的影响
本章小结
第十章 结论
参考文献
作者在攻读博士学位期间发表论著与参加科研情况
致 谢
发布时间: 2006-05-24
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