Cjhppd基因单子叶植物表达载体构建及水稻的遗传转化

论文摘要

对羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)是酪氨酸分解代谢过程第二步所需的酶,它催化对羟基苯丙酮酸转化为尿黑酸。在植物体内,尿黑酸是维生素E和质体醌的前体,所以HPPD又间接控制着这两类物质的合成。三酮类、吡唑类和异恶唑类这三类除草剂家族以HPPD为靶位点,竞争性抑制HPPD酶活,造成植物白化并死亡。同时,抗除草剂的转基因农作物也引起了人们广泛的兴趣和关注。研究发现,黄连HPPD对吡唑类除草剂DTP具有一定抗性。水稻(Oryza saliva L.)是作为单子叶遗传转化的模式植物为其它禾本科作物基因转化和基因调控研究奠定了基础。近十几年水稻基因的研究发展迅速,部分品种水稻完成了全基因组草图测序并通过使用转基因技术获得了大量稳定遗传的转基因水稻植株。人们试图将一些有用的基因转入水稻,用于研究在单子叶模式植物中的表达。本研究构建了具有除草剂抗性的Cjhppd基因的单子叶植物表达载体,通过农杆菌介导法转化水稻,经PCR检测初步验证了Cjhppd基因已导入水稻。主要实验结果如下：1.构建了单子叶植物表达载体,该载体中含有Cjhppd基因片段、玉米泛素的启动子Ubi、选择性标记基因Hpt。2.用日本晴水稻种子诱导的愈伤组织作为转化的受体材料,通过根癌农杆菌介导法将Cjhppd基因转入水稻,共培养189块日本晴水稻愈伤组织,三次筛选继代培养后,获得76个抗性愈伤组织,抗性愈伤组织产生率为40.2%,其中33个抗性愈伤组织分化出再生植株,抗性植株转化率为17.5%。3.提取转基因水稻基因组DNA,经PCR检测初步验证了Cjhppd基因已导入水稻。农杆菌转化水稻获得了转基因植株33株,其中经PCR检测阳性株数为8株,阳性转化效率为24.2%。4.水稻叶片除草剂DTP抗性分析的初步结果显示,在DTP胁迫下转基因水稻叶片白化程度都明显低于野生型的水稻。转基因水稻叶片中叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素含量都明显高于未转化的野生型水稻。初步判断,转Cjhppd基因水稻表现出了除草剂抗性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 文献综述
• 1.1 水稻基因工程研究进展
• 1.2 转基因水稻的受体系统
• 1.2.1 以原生质体为受体的转化系
• 1.2.2 愈伤组织和悬浮细胞:水稻幼胚、成熟胚、幼穗来源的胚性愈伤组织
• 1.2.3 分生组织
• 1.2.4 以生殖细胞:幼嫩子房、花粉、卵细胞、幼胚
• 1.3 转基因水稻的转化方法
• 1.3.1 PEG介导法（PEG-mediated transformation）
• 1.3.2 脂质体介导法（liposome-mediated transformation）
• 1.3.3 电击法（electroporation-mediated transformation）
• 1.3.4 基因枪法（gene gun-mediated transformation）
• 1.3.5 农杆菌介导（Agrobacterium-mediation）的基因转化法
• 1.3.6 激光微束介导基因转化（microlazer-mediated transformation）
• 1.3.7 离子束介导法
• 1.3.8 花粉管通道法
• 1.4 转基因水稻的分子生物学检测方法
• 1.5 抗除草剂转基因水稻的应用
• 1.6 HPPD及其抑制剂的作用机理
• 1.6.1 HPPD介绍
• 1.6.2 HPPD抑制剂的作用原理
• 1.7 HPPD为靶酶的除草剂
• 1.8 国内外对抗HPPD抑制剂农作物的研究进展
• 1.9 本研究的目的和意义
• 第2章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 载体质粒
• 2.1.3 菌株
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 实验药品
• 2.1.6 常用仪器设备
• 2.2 实验流程
• 2.3 植物表达载体的构建
• 2.3.1 Hyg、Ubi基因片段的扩增
• 2.3.2 Cjhppd基因片段的扩增
• 2.3.3 Cjhppd基因片段的电泳分离回收
• 2.3.4 质粒的小量提取
• 2.3.5 大肠杆菌JM109感受态细胞的制备
• 2.3.6 大肠杆菌DH5α感受态细胞的转化
• 2.3.7 构建克隆载体的标准连接体系
• 2.3.8 质粒酶切鉴定体系
• 2.3.9 Cjhppd基因片段与pCambia-1301-UbiN载体的连接
• 2.4 水稻受体系统的建立及转化
• 2.4.1 水稻愈伤组织的诱导
• 2.4.2 农杆菌悬液的制备
• 2.4.3 水稻愈伤组织与农杆菌的共培养
• 2.4.4 抗性愈伤组织的分化
• 2.4.5 生根培养及移栽
• 2.4.6 水稻叶片的潮霉素、除草剂胁迫处理
• 2.5 转基因水稻的分子生物学检测
• 2.5.1 水稻基因组DNA的微量提取
• 2.5.2 Cjhppd基因片段的扩增
• 2.5.3 Hyg、Ubi基因片段的扩增
• 2.5.4 水稻总RNA的提取及定量
• 2.6 转基因水稻叶片光合色素含量的测定
• 第3章 结果与分析
• 3.1 植物表达载体的构建
• 3.1.1 pCambia-1301-UbiN质粒的鉴定
• 3.1.2 Cjhppd基因的PCR扩增结果
• 3.1.3 pGEM-T Easy/Cjhppd克隆载体的构建及鉴定
• 3.1.4 P1301-UbiN/Cjhppd植物表达载体的构建及鉴定
• 3.1.5 植物表达载体转化根癌农杆菌EHA105
• 3.2 水稻转化系统的建立及转化
• 3.2.1 水稻愈伤组织的诱导与继代
• 3.2.2 转化及抗性愈伤组织的筛选
• 3.2.3 分化生根及移栽
• 3.2.4 转基因植株的获得
• 3.3 转基因水稻的分子生物学检测
• 3.3.1 水稻基因组DNA提取及PCR检测
• 3.3.2 水稻总RNA的提取
• 3.4 转基因水稻的抗性分析
• 3.4.1 潮霉素胁迫对水稻幼嫩叶片色素含量的影响
• 3.4.2 除草剂DTP胁迫对水稻幼嫩叶片色素含量的影响
• 第4章 讨论
• 4.1 农杆菌转化水稻的探讨
• 4.2 不同启动子对外源基因表达的影响
• 4.3 正确使用选择标记基因
• 4.4 DTP胁迫对转基因水稻的影响
• 第5章 结论
• 参考文献
• 致谢