马链球菌兽疫亚种多重PCR检测方法建立及应用

论文摘要

马链球菌兽疫亚种（Streptococcus equi ssp.zooepidemicus）是引发猪链球菌病的主要病原,主要引起猪的脑膜炎、败血症、关节炎、肺炎、及突发性死亡。其引起的动物疫病呈世界性分布,是目前危害我国猪群最严重的细菌性传染病之一。在危害集约化养猪业发展的同时,该菌对养猪业的相关从业人员的健康具有潜在威胁。纤连蛋白结合蛋白结合蛋白（fibronectin-binding protein,FNZ）是链球茵一种重要的表面蛋白和毒力因子,是链球菌建立感染所依附的重要的表面分子之一,该蛋白是重要的黏附素之一。其主要的功能是与存在于细胞外基质及细胞表面的纤连蛋白（fibronectin,Fn）发生特异性结合。马链球菌兽疫亚种的类M蛋白（M-like protein,SzP）是一种重要的表面蛋白和毒力因子,具有调理素功能,且能够抵抗抗体的吞噬细胞对其的吞噬作用。根据已经发表的马链球菌兽疫亚种（Streptococcus equi ssp.zooepidemicus）猪源菌株的纤连蛋白结合蛋白序列设计合成一对引物,以ATCC35246株基因组为模板,通过PCR技术扩增纤连蛋白结合蛋白和类M蛋白基因并定向克隆于PMD-19 T载体中,鉴定阳性质粒插入片段的正确性,利用DNAstar软件,比较所测序列与不同来源的链球菌的纤连蛋白结合蛋白序列的同源性,扩增的fnz、szp基因片段的长度为540bp和700bp,该序列与已经发表的马链球菌兽疫亚种相应基因的同源性为99%。以上序列的测定为建立检测马链球菌兽疫亚种多重PCR的方法奠定了基础。根据马链球菌兽疫亚种类M蛋白、纤连蛋白结合蛋白、超氧化物歧化酶A基因已经发表的序列设计和合成引物,建立马链球菌兽疫亚种多重PCR检测方法,并对建立的方法进行优化。结果显示:建立的多重PCR方法具有较好特异性和敏感性,对14株马链球菌兽疫亚种和6株其它相关菌株进行多重PCR检测,只有马链球菌兽疫亚种能够同时扩增出类M蛋白、fnz、SodA基因;其最低可检测模板量为37 ng/ml。根据建立的马链球菌兽疫亚种三重PCR检测方法,对江苏地区奶牛场、屠宰场和某猪场进行了马链球菌兽疫亚种流行病学调查。结合培养特性及形态、染色情况等对其进行检测。在屠宰场分离到1株马链球菌兽疫亚种,在猪场分离到2株马链球菌兽疫亚种。显示该方法在马链球菌的快速诊断和分子流行病学的调查中有实用价值。

论文目录

• 全文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一篇 文献综述
• 马链球菌兽疫亚种及毒力因子
• 第二篇 试验部分
• 第一章 马链球菌兽疫亚种ATCC35246纤连蛋白结合蛋白克隆及序列分析
• 摘要
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 参考文献
• 5 英文摘要
• 第二章 马链球菌兽疫亚种ATCC35246类M蛋白基因的克隆及序列分析
• 摘要
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 参考文献
• 5 英文摘要
• 第三章 马链球菌兽疫亚种多重PCR快速检测方法
• 摘要
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 参考文献
• 5 英文摘要
• 马链球菌兽疫亚种三重PCR快速检测试剂盒说明
• 全文总结
• 致谢