Taq DNA聚合酶的改造及应用

论文摘要

本论文对Taq DNA聚合酶展开了研究,从Taq DNA聚合酶表达载体出发,对其进行定向改造,分别用于探针检测PCR体系和焦磷酸水解激活的聚合酶反应（PAP）技术,最后制备其抗体达到热启动PCR的目的。第一章,概述了Taq DNA聚合酶在PCR中的应用,普通Taq DNA聚合酶虽然得到广泛使用,但是仍然存在不足。各个实验室针对Taq DNA聚合酶的不足进行了不同形式的改造,以降低或消除酶的5’→3’核酸外切酶活性,提高酶的续进性、忠实性、特异性和耐热性等。第二章,我们也通过定点突变和缺失突变的方法在基因水平对Taq DNA聚合酶进行改造,以消除酶的5’→3’核酸外切酶活性和降低Taq DNA聚合酶对ddNTP的抵抗,并对改造后的酶蛋白进行表达纯化。第三章,将改造的酶进行了各方面的应用。第一,应用于探针检测实时PCR体系。在各种基于探针检测的实时PCR体系中,使用普通的Taq DNA聚合酶,有时看不到S型信号升起,在PCR循环的开始,探针的荧光信号本底就很高。我们将改造后的酶应用于探针检测,发现可以很好地解决这一问题,同时也进一步验证了初始荧光信号本底高是由于探针的荧光基团被具有5’→3’核酸外切酶活性的Taq DNA聚合酶酶切造成。第二,应用于PAP技术。PAP技术即焦磷酸水解激活的聚合酶反应技术。在PAP反应体系中,应用普通的Taq DNA聚合酶无法进行突变的检测,我们改造后的Taq-FS DNA聚合酶,可以成功地解决这一问题,进行稀有突变的检测,可以区分单碱基的差异。第三,酶抗体应用实现热启动PCR。在PCR反应中,由于Taq DNA聚合酶在低温下也具有活性,在PCR反应开始之前容易产生非特异性的扩增以及产生引物二聚体,为了解决这个问题,我们制备了酶的抗体,在低温下形成抗原抗体复合物使酶失去活性,只有在较高的温度下酶才得以释放发挥活性。极大的提高了PCR反应的特异性和灵敏度。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 Taq DNA 聚合酶研究进展
• 1.1 提高Taq DNA 聚合酶的续进性
• 1.2 提高Taq DNA 聚合酶的忠实性
• 1.3 提高Taq DNA 聚合酶的耐热性
• 1.4 通过点突变降低Taq DNA 聚合酶5'→3'外切酶活性
• 1.5 降低Taq DNA 聚合酶对ddNTP 的抵抗
• 1.6 提高Taq DNA 聚合酶最适反应温度实现热启动PCR
• 参考文献
• 第二章 Taq DNA 聚合酶的改造
• 第一节 引言
• 第二节 材料与方法
• 第三节 结果
• 3.1 扩增引物验证G46D 突变结果
• 3.2 扩增引物验证G46D+F667Y 突变结果
• 3.3 双酶切验证KlenTaq 的制备结果
• 3.4 双酶切验证Taq-N 的制备结果
• 3.5 酶纯化和活性验证
• 第四节 讨论
• 参考文献
• 第三章 改造后 Taq DNA 聚合酶的应用
• 第一节 引言
• 第二节 材料与方法
• 第三节 结果
• 3.1 在探针检测PCR 体系中的应用
• 3.2 在PAP 技术中的应用
• 3.3 酶抗体的应用实现热启动PCR的结果
• 第四节 讨论
• 参考文献
• 总结
• 致谢